| 中文摘要 | 第1-26页 |
| 英文摘要 | 第26-36页 |
| 符号说明 | 第36-38页 |
| 第一部分 HBV及其片断HBc、HBx对补体介导的肝细胞杀伤作用的影响研究 | 第38-80页 |
| 前言 | 第38-42页 |
| 技术路线 | 第42-43页 |
| 第一章 筛选HBV调控的补体成分 | 第43-55页 |
| 第一节 利用基因芯片进行基因表达谱差异研究 | 第43-49页 |
| 材料与方法 | 第44-47页 |
| 1.材料 | 第44-45页 |
| ·动物 | 第44页 |
| ·引物 | 第44页 |
| ·生化试剂和试剂盒 | 第44页 |
| ·主要仪器设备及其它 | 第44-45页 |
| 2.方法 | 第45-47页 |
| ·组织RNA的提取 | 第45页 |
| ·RNA纯化与质检 | 第45页 |
| ·质检合格RNA送检 | 第45页 |
| ·生物信息学分析 | 第45页 |
| ·部分差异基因的RT-PCR验证 | 第45-47页 |
| 结果 | 第47-48页 |
| 1.RNA质量检测 | 第47页 |
| 2.基因芯片结果的生物信息学分析 | 第47页 |
| 3.补体成分在HBV感染细胞中变化 | 第47页 |
| 4.差异基因的RT-PCR验证 | 第47-48页 |
| 讨论 | 第48-49页 |
| 第二节 HBV转基因小鼠的蛋白质组学研究 | 第49-55页 |
| 材料与方法 | 第49-52页 |
| 1.材料 | 第49-50页 |
| ·动物 | 第49页 |
| ·生化试剂和试剂盒 | 第49-50页 |
| ·主要仪器设备及其它 | 第50页 |
| 2.方法 | 第50-52页 |
| ·蛋白质样品制备与定量 | 第50-51页 |
| ·双向凝胶电泳 | 第51页 |
| ·凝胶的扫描与蛋白点分析 | 第51页 |
| ·数据库查对 | 第51-52页 |
| ·质谱分析 | 第52页 |
| ·Mascot数据库检索 | 第52页 |
| 结果 | 第52-53页 |
| 1.二维电泳结果分析 | 第52-53页 |
| 2.质谱分析结果 | 第53页 |
| 3.Mascot检索结果 | 第53页 |
| 讨论 | 第53-55页 |
| 第二章 HBV对补体杀伤功能的影响及其机制 | 第55-73页 |
| 材料与方法 | 第55-67页 |
| 1.材料 | 第55-58页 |
| ·细胞和细胞培养 | 第55页 |
| ·质粒和菌株 | 第55-56页 |
| ·动物 | 第56页 |
| ·肝切片标本 | 第56页 |
| ·血清 | 第56页 |
| ·生化试剂 | 第56页 |
| ·一般试剂 | 第56-58页 |
| ·主要仪器设备 | 第58页 |
| 2.方法 | 第58-67页 |
| ·质粒的转化及大量扩增 | 第58-61页 |
| ·建立稳定表达HBV的肝细胞系 | 第61-62页 |
| ·基因转染 | 第61页 |
| ·ELISA检测HBsAg、HBeAg在稳定转染HBV细胞中的表达… | 第61-62页 |
| ·HBV转染对补体杀伤活性的影响 | 第62-63页 |
| ·抗肝细胞多克隆抗体的制备 | 第62-63页 |
| ·补体杀伤实验 | 第63页 |
| ·HBV转染对CD59表达的影响 | 第63-66页 |
| ·半定量RT-PCR检测CD59 mRNA的表达 | 第63-64页 |
| ·实时定量PCR检测CD59 mRNA的表达 | 第64页 |
| ·Western blot检测CD59蛋白的表达 | 第64-66页 |
| ·流式细胞术检测CD59蛋白的表达 | 第66页 |
| ·CD59在HBV调控补体杀伤中的作用 | 第66-67页 |
| ·HBV患者肝组织中CD59的表达 | 第67页 |
| 结果 | 第67-70页 |
| 1.多克隆抗体的制备 | 第67页 |
| 2.稳定表达HBV的肝细胞细胞系的建立 | 第67-68页 |
| 3.HBV转染提高补体系统对肝细胞的杀伤率 | 第68页 |
| 4.HBV下调肝细胞上CD59的表达 | 第68-69页 |
| ·RT-PCR及实时定量PCR检测CD59表达 | 第68页 |
| ·流式细胞术检测CD59蛋白质水平的表达 | 第68-69页 |
| ·Western Blot检测CD59蛋白质水平的表达 | 第69页 |
| 5.封闭CD59作用后检测HBV转染对补体杀伤率的影响 | 第69页 |
| 6.HBV患者肝细胞表面CD59的表达水平降低 | 第69页 |
| 7.HBV转基因小鼠肝组织CD59的表达减少 | 第69-70页 |
| 讨论 | 第70-73页 |
| 第三章 HBc及HBx对补体杀伤功能的影响及其机制 | 第73-79页 |
| 材料与方法 | 第73-75页 |
| 1.材料 | 第73-74页 |
| ·质粒和菌株 | 第73页 |
| ·细胞和细胞培养 | 第73-74页 |
| ·生化试剂及其他材料 | 第74页 |
| 2.方法 | 第74-75页 |
| ·试剂盒大量提取质粒pcDNA3、pcDNA3-HBc、pcDNA3-HBx | 第74页 |
| ·转染BEL7402肝细胞株 | 第74-75页 |
| ·各组细胞中CD59表达的水平 | 第75页 |
| ·普通RT-PCR及实时定量PCR检测mRNA水平的表达 | 第75页 |
| ·流式细胞术及Western Blot检测各组细胞中CD59蛋白水平的表达 | 第75页 |
| ·CCK-8法检测阻断CD59前后补体对不同质粒转染的肝细胞杀伤率的变化 | 第75页 |
| ·泛素化对CD59表达水平的影响 | 第75页 |
| 结果 | 第75-77页 |
| 1.稳定表达HBc和HBx的肝细胞细胞系的建立 | 第75页 |
| 2.HBc下调肝细胞上CD59的表达,HBx对CD59表达无明显影响 | 第75-76页 |
| ·RT-PCR及实时定量PCR检测CD59表达 | 第75-76页 |
| ·Western Blot检测CD59蛋白质水平的表达 | 第76页 |
| ·流式细胞术检测CD59蛋白质水平的表达 | 第76页 |
| 3.HBc及HBx转染对补体杀伤率的影响及机制 | 第76页 |
| 4. 泛素化对CD59表达水平影响不明显 | 第76-77页 |
| 讨论 | 第77-79页 |
| 第一部分 小结 | 第79-80页 |
| 第二部分 LPS预处理对DNA免疫的影响及其机制探讨 | 第80-104页 |
| 前言 | 第80-84页 |
| 技术路线 | 第84页 |
| 第一章 LPS预处理对DNA诱导的I型干扰素的影响 | 第84-98页 |
| 材料与方法 | 第84-93页 |
| 1.材料 | 第84-88页 |
| ·动物 | 第84页 |
| ·质粒和菌株 | 第84-86页 |
| ·细胞和细胞培养 | 第86页 |
| ·生化试剂 | 第86-87页 |
| ·主要实验仪器 | 第87-88页 |
| 2.方法 | 第88-93页 |
| ·RAW264.7及BMDM中转染DNA | 第88-89页 |
| ·BMDM的获取 | 第88页 |
| ·LPS预处理后转染细胞 | 第88-89页 |
| ·转染效率的测定 | 第89页 |
| ·李斯特菌感染RAW264.7细胞 | 第89-90页 |
| ·细菌感染 | 第89页 |
| ·感染效率的测定 | 第89-90页 |
| ·LPS预刺激对转染或感染细胞I型干扰素的影响 | 第90-91页 |
| ·RNA抽提 | 第90-91页 |
| ·反转录及实时定量PCR | 第91页 |
| ·双荧光素酶报告基因系统检测LPS预处理对DNA诱导的Ifnb启动子活性的影响 | 第91-92页 |
| ·Western Blot检测转录因子IκB、cJun、IRF3的活化 | 第92-93页 |
| ·细胞的准备 | 第92页 |
| ·变性及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第92-93页 |
| ·转膜 | 第93页 |
| ·Western blot检测转录因子的活化 | 第93页 |
| 3.统计学处理 | 第93页 |
| 结果 | 第93-95页 |
| 1.LPS预处理对转染DNA诱导的I型干扰素产生的影响 | 第93-94页 |
| ·LPS预处理对DNA转染率的影响 | 第93页 |
| ·LPS预处理明显抑制转染DNA诱导的I型干扰素的产生 | 第93-94页 |
| 2.LPS预处理对李斯特菌感染诱导的I型干扰素产生的影响 | 第94页 |
| ·LPS预处理对细菌感染率的影响 | 第94页 |
| ·LPS预处理对李斯特菌感染诱导的Ifnb1产生的影响 | 第94页 |
| 3.LPS预处理抑制DNA转染诱导的Ifnb1启动子活性 | 第94-95页 |
| 4.Western Blot检测cJun、IκB、IRF3的活化 | 第95页 |
| ·非变性电泳后检测IRF3二聚体 | 第95页 |
| ·变性电泳后检测磷酸化的cJun、IKB和IRF3 | 第95页 |
| ·抑制NF-κB或cJun活化对DNA诱导Ifnb1的影响 | 第95页 |
| 讨论 | 第95-98页 |
| 第二章 LPS预处理对DNA诱导的基因表达谱的影响 | 第98-103页 |
| 材料与方法 | 第98-100页 |
| 1.材料 | 第98-99页 |
| ·细胞培养 | 第98页 |
| ·引物 | 第98页 |
| ·生化试剂和试剂盒 | 第98页 |
| ·主要的仪器设备及其它 | 第98-99页 |
| 2.方法 | 第99页 |
| ·RNA的提取 | 第99页 |
| ·RNA纯化质检及送检 | 第99页 |
| ·生物信息学分析 | 第99页 |
| ·Western Blot验证磷酸化的Stat1和SOCS1 | 第99页 |
| ·差异表达基因的Real-time PCR验证 | 第99页 |
| 3.统计学处理 | 第99-100页 |
| 结果 | 第100-101页 |
| 1.RNA定量与质控 | 第100页 |
| 2.基因芯片差异表达结果分析 | 第100页 |
| 3.Real-time PCR验证差异表达的基因 | 第100页 |
| 4.Western Blot检测phospho-Stat1和SOCS1 | 第100-101页 |
| 讨论 | 第101-103页 |
| 第二部分 小结 | 第103-104页 |
| 附图 | 第104-120页 |
| 参考文献 | 第120-133页 |
| 致谢 | 第133-134页 |
| 博士在读期间发表论文及所获荣誉 | 第134-136页 |
| 发表论文 | 第136-151页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第151页 |
