| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 一 前言 | 第10-23页 |
| 1.核酶的发现及分类 | 第10页 |
| 2.RNase P作为分子剪刀的历史以及设计原则 | 第10-13页 |
| 3.M1GS在细胞内稳定，分布和表达 | 第13-18页 |
| 4.M1GS技术的优点 | 第18-19页 |
| 5.HCMV简介 | 第19-22页 |
| 6.课题意义 | 第22-23页 |
| 二 材料和方法 | 第23-39页 |
| 1 主要仪器设备 | 第23页 |
| 2 材料 | 第23-27页 |
| ·细胞株 | 第23-24页 |
| ·质粒和菌株 | 第24页 |
| ·引物和测序 | 第24页 |
| ·主要试剂和试剂盒 | 第24-25页 |
| ·培养基的配制 | 第25页 |
| ·细菌培养基的配置 | 第25页 |
| ·细胞培养基的配置 | 第25页 |
| ·血清的处理 | 第25页 |
| ·其他常用试剂的配置 | 第25-27页 |
| ·质粒DNA提取及纯化所需试剂 | 第25-26页 |
| ·细胞培养常用试剂的配制 | 第26页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳所需溶液 | 第26页 |
| ·所需抗生素的配置 | 第26-27页 |
| ·Northern blot杂交所用试剂配置 | 第27页 |
| 3 实验路线及方法 | 第27-39页 |
| ·核酶T4-M1GS和T7-M1GS的克隆 | 第28-32页 |
| ·核酶M1GS克隆技术路线 | 第28-29页 |
| ·核酶T4-M1GS和T7-M1GS两端引物的设计 | 第29页 |
| ·PCR扩增核酶基因 | 第29页 |
| ·凝胶回收纯化 | 第29-30页 |
| ·载体pLXSN的制备 | 第30页 |
| ·插入片段(核酶T4-M1GS和T7-M1GS PCR片段)和载体(pLXSN)的双酶切、连接 | 第30页 |
| ·制备感受态 | 第30-31页 |
| ·转化 | 第31页 |
| ·碱裂解法抽提质粒验证 | 第31-32页 |
| ·底物片段的克隆 | 第32-34页 |
| ·底物片段克隆技术路线 | 第32页 |
| ·底物片段54-C和54-D两端引物的设计 | 第32-33页 |
| ·PCR扩增(54-C，54-D，54-CD) | 第33页 |
| ·凝胶回收纯化 | 第33页 |
| ·载体pEGFP-N1的制备 | 第33页 |
| ·插入片段(核酶PCR片段)和载体(pEGFP-N1)的双酶切、连接 | 第33-34页 |
| ·制备感受态 | 第34页 |
| ·转化 | 第34页 |
| ·快速抽提法抽提质粒验证 | 第34页 |
| ·细胞复苏和细胞冻存 | 第34页 |
| ·检测Hela细胞耐受G418的临界值 | 第34-35页 |
| ·细胞转染，G418筛选 | 第35-36页 |
| ·转染试剂为Lipofectamine和Plus共用的转染方案 | 第35页 |
| ·转染试剂为Lipofectamine 2000的转染方案 | 第35-36页 |
| ·基因组的抽提、鉴定 | 第36页 |
| ·RNA的抽提 | 第36页 |
| ·RT-PCR | 第36-37页 |
| ·Northern blot | 第37-39页 |
| 三 结果与分析 | 第39-47页 |
| 1.pLXSN质粒扩增，测序，确定U6启动子的存在及MCS位点 | 第39页 |
| 2.扩增T4-M1GS，T7-M1GS的DNA片段，克隆至pLXSN载体上，鉴定 | 第39-40页 |
| 3.扩增底物UL54-C，UL54-D，UL54-CD的DNA片段，克隆至pEGFP载体上，鉴定 | 第40-42页 |
| 4.核酶重组质粒和pEGFP-N1质粒共转染Hela细胞，荧光显微镜检测 | 第42-43页 |
| 5.核酶重组质粒T4-M1GS-pLXSN和底物重组质粒UL54-C-GFP共转染Hela细胞中，荧光显微镜检测 | 第43-44页 |
| 6.将底物重组质粒UL54-CD-GFP转染核酶T4-M1GS稳定表达的Hela细胞中，Northern blot检测 | 第44-46页 |
| 7.核酶重组质粒T7-M1GS-pLXSN与底物重组质粒UL54-CD-GFP共转染Hela细胞，Northern blot检测 | 第46-47页 |
| 四 讨论 | 第47-53页 |
| 1.关于M1GS的可能用途 | 第47-48页 |
| 2.M1GS的不足 | 第48-50页 |
| 3.使用具有报告基团的载体所注意的事项 | 第50-53页 |
| 五 结论 | 第53-54页 |
| 附录 | 第54-60页 |
| 附录1 U6-pLXSN测序结果 | 第54页 |
| 附录2 NCBI上的U6 snRNA序列 | 第54-56页 |
| 附录3 T4-M1GS-pLXSN测序序列 | 第56-57页 |
| 附录4 T7-M1GS-pLXSN测序序列 | 第57页 |
| 附录5 UL54基因全长测序结果(序列) | 第57-59页 |
| 附录6 pEGFP-N1载体测序结果 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-65页 |
| 致谢 | 第65-66页 |
