| 英文缩略词及中文对照 | 第1-17页 |
| 中文摘要 | 第17-19页 |
| 英文摘要 | 第19-21页 |
| 第一章 前言 | 第21-65页 |
| 第一节 丝状真菌的遗传转化研究进展 | 第21-42页 |
| 1 丝状真菌的转化方法 | 第22-41页 |
| ·原生质体-PEG 转化 | 第22页 |
| ·脂质体转化法 | 第22页 |
| ·电击转化法 | 第22页 |
| ·醋酸锂转化法 | 第22-23页 |
| ·限制酶介导的转化(restriction enzyme-mediated integration,REMI) | 第23-28页 |
| ·REMI 的机理 | 第23页 |
| ·REMI 转化的一般步骤 | 第23-24页 |
| ·REMI 插入突变的主要优点 | 第24-25页 |
| ·REMI 在植物病原真菌上的应用 | 第25-26页 |
| ·REMI 技术的其他用途 | 第26-27页 |
| ·REMI 技术的展望 | 第27-28页 |
| ·农杆菌介导的转化 | 第28-41页 |
| ·根癌农杆菌 | 第29页 |
| ·农杆菌的生物学特性 | 第29页 |
| ·农杆菌的分类 | 第29页 |
| ·农杆菌Ti 质粒的结构 | 第29-30页 |
| ·根癌农杆菌介导真菌遗传转化的机理 | 第30-31页 |
| ·根癌农杆菌介导转化的真菌种类 | 第31-38页 |
| ·根癌农杆菌介导丝状真菌转化的特点 | 第38-39页 |
| ·根癌农杆菌介导真菌遗传转化的应用 | 第39-41页 |
| ·农杆菌介导真菌遗传转化技术展望 | 第41页 |
| 2 关于轮枝镰孢菌和纤细齿梗孢的遗传转化 | 第41-42页 |
| 第二节 蛋白激酶及其信号通路研究进展 | 第42-62页 |
| 1 蛋白激酶概述 | 第42-48页 |
| ·蛋白激酶在细胞信号转导中的作用和意义 | 第42-43页 |
| ·蛋白激酶的分类研究 | 第43-44页 |
| ·蛋白激酶的共同特征 | 第44-47页 |
| ·蛋白激酶一级结构的特征 | 第45-47页 |
| ·蛋白激酶的生化特征 | 第47页 |
| ·蛋白激酶的调控机制 | 第47-48页 |
| ·蛋白激酶对靶底物的调控方式 | 第47-48页 |
| ·蛋白激酶活性的激活和抑制 | 第48页 |
| 2 真菌及植物病原真菌蛋白激酶的研究现状 | 第48-62页 |
| ·蛋白激酶在真菌信号传导中的作用 | 第48-49页 |
| ·丝状真菌蛋白激酶的种类及研究现状 | 第49-62页 |
| ·cAMP 依赖性蛋白激酶PKA | 第50-53页 |
| ·蛋白激酶C | 第53-54页 |
| ·促分裂蛋白激酶 MAPK | 第54-60页 |
| ·其他的Ser/Thr 激酶 | 第60-62页 |
| 第三节 本研究的立题依据、研究内容和技术路线 | 第62-65页 |
| 1 立题依据 | 第62页 |
| 2 研究内容 | 第62-63页 |
| 3 技术路线 | 第63-65页 |
| 第二章 轮枝镰孢菌和纤细齿梗孢遗传转化体系建立及随机插入突变体的筛选 | 第65-104页 |
| 第一节 限制性内切酶介导的轮枝镰孢菌和纤细齿梗孢的遗传转化 | 第65-86页 |
| 1 材料与方法 | 第65-72页 |
| ·材料和试剂 | 第65-67页 |
| ·供试菌株和质粒 | 第66页 |
| ·试剂和药品 | 第66页 |
| ·仪器和设备 | 第66页 |
| ·培养基及配制 | 第66页 |
| ·溶液配制 | 第66-67页 |
| ·实验方法 | 第67-72页 |
| ·原生质体的制备与再生 | 第67-68页 |
| ·菌龄对原生质体制备的影响 | 第68页 |
| ·酶浓度对原生质体制备的影响 | 第68页 |
| ·酶解时间对原生质体制备的影响 | 第68页 |
| ·酶解温度对原生质体制备的影响 | 第68页 |
| ·稳渗剂对原生质体制备的影响 | 第68页 |
| ·原生质体的纯化 | 第68页 |
| ·质粒pUCATPH 的扩增、提取 | 第68-69页 |
| ·质粒pUCATPH 的线性化 | 第69页 |
| ·DNA 琼脂糖凝胶电泳 | 第69-70页 |
| ·潮霉素B 对轮枝孢镰孢菌和纤细齿梗孢菌丝生长和孢子萌发抑制浓度的筛选 | 第70页 |
| ·REMI 转化 | 第70-71页 |
| ·转化子的PCR 检测 | 第71-72页 |
| ·被转化菌总DNA 的提取 | 第71页 |
| ·PCR 检测 | 第71-72页 |
| ·转化子的稳定性测定 | 第72页 |
| ·突变体的表型鉴定 | 第72页 |
| ·突变体致病性测定 | 第72页 |
| 2 结果与分析 | 第72-80页 |
| ·原生质体制备 | 第72-76页 |
| ·不同条件对原生质体制备的影响 | 第72-75页 |
| ·菌龄对原生质体制备的影响 | 第72-73页 |
| ·溶壁酶浓度对原生质体制备的影响 | 第73-74页 |
| ·酶解时间对原生质体制备的影响 | 第74页 |
| ·酶解温度对原生质体制备的影 | 第74-75页 |
| ·稳渗剂对原生质体制备的影响 | 第75页 |
| ·原生质体的再生 | 第75页 |
| ·原生质体形成与再生过程的显微镜观察 | 第75-76页 |
| ·线性质粒pUCATPH 的制备 | 第76页 |
| ·轮枝镰孢的潮霉素最佳抑制浓度的筛选 | 第76-78页 |
| ·REMI 转化 | 第78页 |
| ·转化子的PCR 验证 | 第78-79页 |
| ·表型突变体的鉴定 | 第79页 |
| ·致病性突变体 | 第79-80页 |
| 3 结论与讨论 | 第80-86页 |
| ·原生质体的制备与再生 | 第80-82页 |
| ·影响原生质体制备的因素 | 第80-81页 |
| ·影响原生质体再生的因素 | 第81-82页 |
| ·REMI 转化 | 第82-86页 |
| ·REMI 的插入位点 | 第82-83页 |
| ·REMI 中的限制性内切酶 | 第83-84页 |
| ·REMI 中的质粒 | 第84-85页 |
| ·REMI 的局限性 | 第85-86页 |
| 第二节 根癌农杆菌介导的轮枝镰孢菌遗传转化及T-DNA插入突变体的获得 | 第86-101页 |
| 1 材料和方法 | 第86-92页 |
| ·材料 | 第86-87页 |
| ·供试菌和转化质粒 | 第86页 |
| ·抗生素和试剂 | 第86页 |
| ·培养基 | 第86-87页 |
| ·载体的构建 | 第87-89页 |
| ·重组质粒转化农杆菌LBA4404 受体细胞 | 第89-90页 |
| ·抑制农杆菌生长的抗生素最佳浓度筛选 | 第90页 |
| ·农杆菌介导的遗传转化操作方法 | 第90-91页 |
| ·转化条件变化对转化效率的影响 | 第91页 |
| ·AS 浓度的影响 | 第91页 |
| ·共培养时间的影响 | 第91页 |
| ·受体菌孢子浓度的影响 | 第91页 |
| ·农杆菌浓度的影响 | 第91页 |
| ·转化子的PCR 分析 | 第91页 |
| ·转化子的稳定性测定 | 第91-92页 |
| ·表型突变体的鉴定 | 第92页 |
| 2 结果与分析 | 第92-98页 |
| ·载体pROK2-PtrpC-hph-TtrpC 的构建 | 第92-94页 |
| ·在pROK2 基础上构建pROK2-PtrpC-hph-TtrpC 二元载体 | 第92页 |
| ·质粒pUCATPH 和pROK2 的酶切产物 | 第92-93页 |
| ·含潮霉素B 抗性基因的DNA 片段PtrpC-hph-TtrpC 的插入识别 | 第93-94页 |
| ·农杆菌对头孢霉素敏感性的测定结果 | 第94-95页 |
| ·轮枝镰孢菌的ATMT 转化 | 第95-97页 |
| ·转化结果 | 第95页 |
| ·转化条件对转化效率的影响 | 第95-97页 |
| ·转化子的PCR 验证 | 第97-98页 |
| ·稳定性检验 | 第98页 |
| ·表型观察 | 第98页 |
| 3 结论与讨论 | 第98-101页 |
| ·农杆菌菌株的选择 | 第99页 |
| ·共培养时间 | 第99页 |
| ·共培养温度 | 第99-100页 |
| ·AS 的浓度 | 第100页 |
| ·农杆菌和受体菌的比例 | 第100-101页 |
| 第三节 本章小结 | 第101-104页 |
| 1 结果及原因分析 | 第101-103页 |
| ·结果 | 第101页 |
| ·原因分析 | 第101-103页 |
| 2 下一步工作建议与展望 | 第103-104页 |
| ·关于纤细齿梗孢的转化 | 第103页 |
| ·关于轮枝镰孢菌的转化 | 第103-104页 |
| 第三章 两种真菌丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶基因的克隆 | 第104-175页 |
| 第一节 轮枝镰孢 cAMP 依赖的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶基因 fpk1 的克隆 | 第104-130页 |
| 1 材料和方法 | 第104-116页 |
| ·材料 | 第104-105页 |
| ·供试菌株与质粒 | 第104-105页 |
| ·酶和生化试剂 | 第105页 |
| ·主要仪器和设备 | 第105页 |
| ·培养基 | 第105页 |
| ·试剂与溶液的配置 | 第105页 |
| ·目的基因的克隆 | 第105-116页 |
| ·引物设计 | 第105-107页 |
| ·总RNA 的提取（Trizol 法） | 第107页 |
| ·紫外检测RNA 产率和纯度 | 第107页 |
| ·反转录cDNA 第一链的合成 | 第107-108页 |
| ·目的基因cDNA 中间片段的分离 | 第108-110页 |
| ·基因cDNA 中间片段的扩增 | 第108页 |
| ·PCR 产物回收 | 第108页 |
| ·载体连接 | 第108-109页 |
| ·大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备和转化 | 第109页 |
| ·DH5α感受态制备 | 第109页 |
| ·大肠杆菌感受态的转化 | 第109页 |
| ·重组质粒的筛选与鉴定 | 第109-110页 |
| ·IPTG-X-gal 筛选 | 第109页 |
| ·菌落PCR 检测 | 第109-110页 |
| ·碱法小量提取质粒DNA | 第110页 |
| ·质粒DNA 的酶切鉴定 | 第110页 |
| ·序列测定 | 第110页 |
| ·目的基因3’末端的分离（3’-RACE） | 第110-111页 |
| ·目的基因5’末端的分离（5’-RACE） | 第111-116页 |
| ·蛋白激酶基因 fpk1 的全长 DNA 序列的克隆 | 第116页 |
| ·全长序列的生物信息学分析 | 第116页 |
| 2 结果与分析 | 第116-130页 |
| ·总 RNA 的提取 | 第116页 |
| ·中间片段的获得 | 第116-118页 |
| ·fpk1 基因的 3’端序列的获得 | 第118-120页 |
| ·fpk1 基因 5’端序列的获得 | 第120-124页 |
| ·fpk1 基因全长 DNA 序列的克隆 | 第124-125页 |
| ·基因fpk1预测蛋白的相似性比对 | 第125-127页 |
| ·基因 fpk1 预测编码蛋白的结构分析 | 第127-130页 |
| 第二节 纤细齿梗孢一丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶基因 opk1 的克隆及序列分析 | 第130-148页 |
| 1 材料和方法 | 第130-132页 |
| ·菌株 | 第130页 |
| ·酶和生化试剂 | 第130页 |
| ·主要仪器和设备 | 第130页 |
| ·培养基、试剂与溶液 | 第130页 |
| ·实验方法 | 第130-132页 |
| ·引物设计 | 第130页 |
| ·OPK1 基因中间片段的克隆 | 第130-131页 |
| ·opk1 基因全长序列的克隆 | 第131-132页 |
| 2 结果与分析 | 第132-148页 |
| ·opk1 中间片段的获得 | 第132-133页 |
| ·蛋白激酶基因 opk15’端序列的克隆 | 第133-137页 |
| ·opk1基因3’端克隆 | 第137-139页 |
| ·全长序列的拼接与扩增 | 第139-143页 |
| ·相似性比对与预测蛋白的结构及功能分析 | 第143-148页 |
| 第三节 轮枝镰孢和纤细齿梗孢 FUS3/KSS1 类 MAPK 基因的克隆与序列分析 | 第148-167页 |
| 1 实验材料和方法 | 第148-149页 |
| ·材料 | 第148-149页 |
| ·供试菌株 | 第148页 |
| ·酶和生化试剂 | 第148-149页 |
| ·主要仪器和设备 | 第149页 |
| ·培养基、试剂与溶液 | 第149页 |
| ·实验方法 | 第149页 |
| ·引物设计 | 第149页 |
| ·两基因中间片段的克隆 | 第149页 |
| ·基因两端序列的克隆 | 第149页 |
| ·基因全长 DNA 和 cDNA 序列的克隆 | 第149页 |
| ·基因的同源性分析及功能预测 | 第149页 |
| 2 结果与分析 | 第149-167页 |
| ·两基因中间片段的获得 | 第149-152页 |
| ·两基因3’端序列的克隆 | 第152-154页 |
| ·两基因5’末端序列的获得 | 第154-157页 |
| ·两基因全长 DNA 和 cDNA 序列的克隆及分析 | 第157-163页 |
| ·两基因的相似性分析 | 第163-165页 |
| ·两基因预测蛋白的结构和功能分析 | 第165-167页 |
| 第四节 本章结论与讨论 | 第167-175页 |
| 1 结论 | 第167页 |
| 2 讨论 | 第167-175页 |
| ·菌丝总RNA 的提取 | 第168页 |
| ·PCR 引物设计 | 第168-170页 |
| ·RACE 技术 | 第170-172页 |
| ·TAIL-PCR 有关问题 | 第172-174页 |
| ·PCR 常见问题及解决方案 | 第174-175页 |
| 第四章 轮枝镰孢两蛋白激酶 fpk1 和 fmk1 的功能研究 | 第175-215页 |
| 第一节 轮枝镰孢 cAMP 依赖的蛋白激酶 fpk1 的功能研究 | 第175-196页 |
| 1 材料与方法 | 第175-183页 |
| ·材料 | 第175页 |
| ·仪器和设备 | 第175页 |
| ·载体、酶、试剂和溶液等 | 第175-176页 |
| ·方法 | 第176-183页 |
| ·构建突变载体 | 第176-178页 |
| ·策略 | 第176页 |
| ·步骤及流程 | 第176-178页 |
| ·原生质体制备和REMI 转化 | 第178页 |
| ·转化子和突变体的筛选 | 第178-179页 |
| ·Southern 杂交 | 第179-182页 |
| ·试剂及溶液配置 | 第179页 |
| ·杂交探针的制备 | 第179-180页 |
| ·基因组 DNA 提取和酶切 | 第180页 |
| ·电泳 | 第180-181页 |
| ·印迹 | 第181页 |
| ·凝胶处理 | 第181页 |
| ·印迹 | 第181页 |
| ·预杂交与杂交 | 第181-182页 |
| ·洗膜与显影 | 第182页 |
| ·蛋白激酶基因的 RT-PCR | 第182页 |
| ·突变体表型分析 | 第182-183页 |
| ·菌落生长及菌丝分化状态观察 | 第182页 |
| ·孢子产生及萌发情况分析 | 第182-183页 |
| ·溶壁酶酶解菌丝比较 | 第183页 |
| ·致病性测定 | 第183页 |
| 2 结果与分析 | 第183-196页 |
| ·载体的构建 | 第183-186页 |
| ·蛋白激酶基因全长DNA 序列的克隆 | 第183-184页 |
| ·第一步重组 | 第184-185页 |
| ·第二步重组 | 第185-186页 |
| ·REMI 转化及突变体的筛选验证 | 第186-188页 |
| ·Southern 杂交 | 第188-190页 |
| ·蛋白激酶基因的 RT-PCR | 第190-191页 |
| ·突变体表型变化的研究 | 第191-196页 |
| ·菌丝生长的变化 | 第191-192页 |
| ·突变体产孢量能力的变化 | 第192-193页 |
| ·孢子萌发与芽管伸长的变化 | 第193-194页 |
| ·溶壁酶酶解菌丝的差别 | 第194页 |
| ·对玉米幼苗致病性的变化 | 第194-196页 |
| 第二节 轮枝镰孢蛋白激酶基因 fmk1 的功能研究 | 第196-212页 |
| 1 材料与方法 | 第196-201页 |
| ·材料和菌株 | 第196页 |
| ·仪器和设备 | 第196页 |
| ·载体、酶、试剂和溶液等 | 第196页 |
| ·方法 | 第196-201页 |
| ·构建突变载体 | 第196-199页 |
| ·策略及流程 | 第196-197页 |
| ·fmk1 基因上、下游片段的 PCR 扩增 | 第197-198页 |
| ·第一步重组 | 第198-199页 |
| ·第二步重组 | 第199页 |
| ·原生质体制备和REMI 转化 | 第199页 |
| ·转化子和突变体的筛选 | 第199页 |
| ·Southern 杂交验证 | 第199页 |
| ·蛋白激酶基因的 RT-PCR | 第199-200页 |
| ·突变体表型分析 | 第200-201页 |
| ·菌落生长及菌丝分化状态观察 | 第200页 |
| ·孢子产生及萌发情况分析 | 第200页 |
| ·溶壁酶酶解及胞壁分化影响的分析 | 第200页 |
| ·致病性测定 | 第200-201页 |
| 2 结果与分析 | 第201-212页 |
| ·载体的构建 | 第201-202页 |
| ·上下游基因片段的扩增 | 第201页 |
| ·第一次重组 | 第201-202页 |
| ·第二次重组 | 第202页 |
| ·REMI 转化和敲除突变体的筛选 | 第202-205页 |
| ·Southern 杂交结果 | 第205-206页 |
| ·蛋白激酶基因的 RT-PCR | 第206-207页 |
| ·突变体表性分析 | 第207-212页 |
| ·生长与形态变化 | 第207-209页 |
| ·产孢量的变化 | 第209页 |
| ·孢子萌发与芽管伸长的变化 | 第209-210页 |
| ·致病性变化 | 第210-212页 |
| 第三节 本章结论和讨论 | 第212-215页 |
| 1 结论 | 第212页 |
| 2 讨论 | 第212-215页 |
| 参考文献 | 第215-235页 |
| 附录 | 第235-236页 |
| 致谢 | 第236-237页 |
| 攻读学位期间发表论文 | 第237页 |
