| 中文摘要 | 第1-19页 |
| Abstract | 第19-25页 |
| 第一章 文献综述 | 第25-65页 |
| 引言 | 第25页 |
| 1 辣椒疫病的研究进展 | 第25-29页 |
| ·辣椒疫病的发生危害情况 | 第25-26页 |
| ·辣椒疫病发生规律和发病条件 | 第26页 |
| ·辣椒疫霉及其生物学特性 | 第26-27页 |
| ·辣椒疫霉的生理分化 | 第27-28页 |
| ·辣椒疫病的防治 | 第28-29页 |
| ·农业防治 | 第28页 |
| ·化学防治 | 第28-29页 |
| ·生物防治 | 第29页 |
| 2 植物病原真菌致病基因的研究进展 | 第29-35页 |
| ·与侵染结构产生有关的基因 | 第30页 |
| ·与细胞壁降解有关的基因 | 第30-32页 |
| ·与寄主代谢反应产物有关的基因 | 第32-33页 |
| ·毒素基因 | 第33-34页 |
| ·与信号传导有关的基因 | 第34页 |
| ·其它功能的致病基因 | 第34-35页 |
| 3 植物病原菌细胞壁降解酶的研究现状 | 第35-38页 |
| ·细胞壁降解酶的分类 | 第36-38页 |
| ·植物细胞壁降解酶的抑制子 | 第38页 |
| 4 果胶酶的研究进展 | 第38-42页 |
| ·果胶酶的分类 | 第39-40页 |
| ·原果胶酶(protopectinases) | 第39页 |
| ·多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonases) | 第39-40页 |
| ·果胶裂解酶(pectate lyases) | 第40页 |
| ·果胶甲基酯酶( Pectin methylesterases) | 第40页 |
| ·果胶酶在致病过程中的作用 | 第40-41页 |
| ·微生物果胶酶基因 | 第41-42页 |
| ·果胶酶活力的检测方法 | 第42页 |
| ·滴定法 | 第42页 |
| ·黏度下降法 | 第42页 |
| ·脱胶作用时间法 | 第42页 |
| ·还原糖测定法 | 第42页 |
| ·235nm 处紫外吸收测定法 | 第42页 |
| 5 果胶甲基酯酶的研究进展 | 第42-52页 |
| ·果胶甲基酯酶的存在与来源 | 第43页 |
| ·果胶甲基酯酶的基本生物学特征 | 第43-46页 |
| ·果胶甲基酯酶的分子量及分子组成 | 第43-44页 |
| ·果胶甲基酯酶的初级结构 | 第44-45页 |
| ·果胶甲基酯酶的三级结构 | 第45-46页 |
| ·果胶甲基酯酶的性质与作用机理 | 第46-47页 |
| ·果胶甲基酯酶的活性 | 第47-48页 |
| ·果胶甲基酯酶活性的调节 | 第47页 |
| ·果胶甲基酯酶活性测定方法与分析 | 第47-48页 |
| ·植物中果胶甲基酯酶的研究进展 | 第48-50页 |
| ·植物果胶甲基酯酶特性 | 第48-49页 |
| ·果胶甲基酯酶在植物发育过程中的功能 | 第49页 |
| ·植物果胶甲基酯酶的基因克隆 | 第49-50页 |
| ·果胶甲基酯酶在植物病原菌中的研究 | 第50-52页 |
| ·果胶甲基酯酶在植物病原细菌中的研究 | 第50-51页 |
| ·果胶甲基酯酶在植物病原卵菌及真菌中的研究 | 第51页 |
| ·果胶甲基酯酶突变体的研究 | 第51-52页 |
| ·果胶甲基酯酶异源表达的研究 | 第52页 |
| 6 蛋白糖基化的研究进展 | 第52-55页 |
| ·糖基化位点的功能 | 第52-53页 |
| ·糖基化位点的识别方法 | 第53页 |
| ·糖基化蛋白的去糖基化 | 第53-55页 |
| ·外切型糖苷酶(Exo- glycosidase) | 第54页 |
| ·内切型糖苷酶(Endo- glycosidase) | 第54页 |
| ·糖胺酶(Glycoam idase, N - 糖苷酶) | 第54-55页 |
| 7 利用酵母体系表达异源蛋白的研究进展 | 第55-60页 |
| ·酵母表达体系的优点 | 第55页 |
| ·毕赤酵母表达体系 | 第55-60页 |
| ·巴斯德毕赤酵母的生物学特性 | 第56-57页 |
| ·毕赤酵母宿主菌和表达载体的类型 | 第57-58页 |
| ·表达载体在毕赤酵母中的整合 | 第58-59页 |
| ·巴斯德毕赤酵母中信号肽的剪切过程 | 第59-60页 |
| 8 重组蛋白纯化的研究进展 | 第60-64页 |
| ·多聚精氨酸一标签(Arg-tag) | 第60-61页 |
| ·多聚组氨酸一标签(His-tag) | 第61-62页 |
| ·FLAG-标签 | 第62页 |
| ·谷胱甘肽S-转移酶标签 | 第62-63页 |
| ·s-标签 | 第63页 |
| ·SBP-标签 | 第63-64页 |
| 选题目的及意义 | 第64-65页 |
| 第二章 强致病辣椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基酯酶、果胶裂解酶活性测定 | 第65-72页 |
| 1 材料与方法 | 第65-67页 |
| ·材料 | 第65-66页 |
| ·方法 | 第66-67页 |
| ·辣椒疫霉菌果胶酶粗酶液的提取 | 第66页 |
| ·多聚半乳糖醛酸酶的活性测定 | 第66页 |
| ·果胶甲基酯酶的活性测定 | 第66页 |
| ·果胶裂解酶的活性测定 | 第66页 |
| ·粗酶液接种辣椒发病 | 第66-67页 |
| 2 结果与分析 | 第67-69页 |
| ·强致病辣椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶活性比较 | 第67页 |
| ·强致病辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶活性比较 | 第67-68页 |
| ·强致病辣椒疫霉菌果胶裂解酶活性比较 | 第68-69页 |
| ·粗酶液接种辣椒后发病面积比较 | 第69页 |
| 3 讨论 | 第69-72页 |
| 第三章 辣椒疫霉果胶甲基酯酶基因克隆及序列分析 | 第72-112页 |
| 1 材料与方法 | 第72-79页 |
| ·材料 | 第72-74页 |
| ·供试菌株 | 第72页 |
| ·菌株与质粒 | 第72页 |
| ·酶和生化试剂 | 第72页 |
| ·仪器 | 第72页 |
| ·培养基 | 第72-73页 |
| ·溶液配制 | 第73页 |
| ·引物设计 | 第73-74页 |
| ·实验方法 | 第74-79页 |
| ·96 个克隆总质粒DNA 的大量提取（碱裂解法） | 第74-75页 |
| ·16 个克隆总质粒DNA 的提取 | 第75页 |
| ·单个克隆质粒DNA 的提取 | 第75页 |
| ·Pool PCR 法筛选基因组文库 | 第75-76页 |
| ·全长序列基因的生物信息学分析 | 第76-79页 |
| 2 结果与分析 | 第79-109页 |
| ·辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶PCPME1 基因的克隆及其序列分析 | 第80-85页 |
| ·pcpme1 基因的克隆 | 第80页 |
| ·pcpme1 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析 | 第80-82页 |
| ·PCPME1 的氨基酸组成 | 第82-83页 |
| ·PCPME1 的二级结构预测 | 第83-85页 |
| ·辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶PCPME2 基因的序列及结构分析 | 第85-91页 |
| ·pcpme2 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析 | 第85-87页 |
| ·PCPME2 的氨基酸组成 | 第87-88页 |
| ·PCPME2 的二级结构预测 | 第88-91页 |
| ·辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶PCPME3 基因的序列及结构分析 | 第91-96页 |
| ·pcpme3 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析 | 第91-92页 |
| ·PCPME3 的氨基酸组成 | 第92-93页 |
| ·PCPME3 的二级结构预测 | 第93-96页 |
| ·辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶PCPME4 基因的序列及结构分析 | 第96-101页 |
| ·pcpme4 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析 | 第96-98页 |
| ·PCPME4 的氨基酸组成 | 第98页 |
| ·PCPME4 的二级结构预测 | 第98-101页 |
| ·辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶PCPME5 基因的序列及结构分析 | 第101-107页 |
| ·pcpme5 基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析 | 第102-103页 |
| ·PCPME4 的氨基酸组成 | 第103-104页 |
| ·PCPME5 的二级结构预测 | 第104-107页 |
| ·辣椒疫霉5 个果胶甲基酯酶基因的比较 | 第107-108页 |
| ·辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶基因在自然界中的进化分析 | 第108-109页 |
| 3 讨论 | 第109-112页 |
| ·辣椒疫霉果胶甲基酯酶基因的序列特征 | 第109-110页 |
| ·辣椒疫霉果胶甲基酯酶酶基因家族的生物学意义 | 第110-111页 |
| ·辣椒疫霉果胶甲基酯酶基因与其它 PMEs 的关系 | 第111-112页 |
| 第四章 辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶基因在寄主体内的表达 | 第112-122页 |
| 1 材料与方法 | 第112-118页 |
| ·材料 | 第112页 |
| ·方法 | 第112-118页 |
| ·接种辣椒叶片 | 第112页 |
| ·受试辣椒叶片总RNA 的提取和cDNA 的合成 | 第112-113页 |
| ·RT-PCR | 第113-114页 |
| ·Northern Blot | 第114-118页 |
| ·Western Blot 检测pcpme1 在辣椒寄主内的表达情况 | 第118页 |
| 2 结果与分析 | 第118-121页 |
| ·RT-PCR 扩增结果 | 第118-119页 |
| ·Northern Blot 分析 | 第119-121页 |
| ·探针的制备 | 第119页 |
| ·Northern Blot 分析 | 第119-120页 |
| ·Western Blot 检测 | 第120-121页 |
| 3 讨论 | 第121-122页 |
| 第五章 辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶 pcpme1 基因的体外表达、纯化及其活性位点的定点突变 | 第122-154页 |
| 1 pcpme1 基因的体外表达、纯化 | 第122-136页 |
| ·材料 | 第122-124页 |
| ·菌株和质粒 | 第122页 |
| ·酶和生化试剂 | 第122-123页 |
| ·培养基及有关溶液的配制 | 第123-124页 |
| ·主要仪器设备 | 第124页 |
| ·实验方法 | 第124-136页 |
| ·果胶甲基酯酶基因pcpme1 成熟肽基因序列的分离 | 第124-126页 |
| ·果胶甲基酯酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第126-134页 |
| ·果胶甲基酯酶融合蛋白的纯化及活性测定 | 第134-135页 |
| ·纯化PCPME1 的去糖基化 | 第135-136页 |
| ·特异性抗血清的制备 | 第136页 |
| 2 pcpme1 基因活性位点的定点突变 | 第136-138页 |
| ·试剂材料 | 第136页 |
| ·pcpme1 基因活性位点的确定 | 第136页 |
| ·定点突变 | 第136-138页 |
| 3 结果与分析 | 第138-148页 |
| ·果胶甲基酯酶基因 pcpme1 在毕赤酵母中的表达 | 第138-145页 |
| ·pcpme1 成熟肽基因序列的分离 | 第138页 |
| ·酵母表达载体的构建和鉴定 | 第138-142页 |
| ·重组表达载体pPIC9K/pcpme1 转化 Pichia pastaris GS115 及酵母转化子的筛选 | 第142-145页 |
| ·PCPME1 融合蛋白的纯化及活性测定 | 第145-146页 |
| ·纯化蛋白的去糖基化 | 第146页 |
| ·去糖基化PCPME1 的SDS-PAGE 分析 | 第146页 |
| ·去糖基化PCPME1 的活性测定 | 第146页 |
| ·兔抗血清的制备 | 第146-147页 |
| ·pcpme1 的定点突变 | 第147-148页 |
| ·突变后基因序列分析 | 第147页 |
| ·突变后表达蛋白的纯化 | 第147-148页 |
| ·突变后蛋白的活性测定 | 第148页 |
| 4 讨论 | 第148-154页 |
| ·表达系统的选择 | 第148-149页 |
| ·外源基因在 Pichia pastoris 中的分泌表达的必要性 | 第149页 |
| ·影响外源基因表达量的因素 | 第149-154页 |
| 第六章 辣椒疫霉果胶甲基酯酶PCPME1 及其突变体对辣椒细胞壁的降解 | 第154-163页 |
| 1 材料与方法 | 第154-155页 |
| ·材料 | 第154页 |
| ·方法 | 第154-155页 |
| ·辣椒幼苗叶片的接种 | 第154页 |
| ·透射电镜观察 | 第154-155页 |
| 2 结果与分析 | 第155-162页 |
| 3 讨论 | 第162-163页 |
| 结论与建议 | 第163-166页 |
| 1 结论 | 第163-164页 |
| 2 建议 | 第164-166页 |
| 参考文献 | 第166-185页 |
| 致谢 | 第185-186页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第186页 |
