| 致谢 | 第1-4页 |
| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-9页 |
| 前言 | 第9-11页 |
| 1 本论文研究的背景 | 第9页 |
| 2 本论文研究目的和意义 | 第9页 |
| 3 本论文主要研究内容 | 第9页 |
| 4 本论文的创新点 | 第9-11页 |
| 第1章 绪论 | 第11-21页 |
| ·植酸 | 第11-12页 |
| ·植酸结构及理化性质 | 第11页 |
| ·植酸的抗营养作用 | 第11-12页 |
| ·植酸酶的种类和来源 | 第12页 |
| ·植酸酶的种类 | 第12页 |
| ·植酸酶的来源 | 第12页 |
| ·植酸酶的结构与作用机制 | 第12-14页 |
| ·植酸酶分子结构与空间构象 | 第12-13页 |
| ·植酸酶活性部位 | 第13页 |
| ·植酸酶作用底物的机制 | 第13-14页 |
| ·植酸酶及其基因的研究进展 | 第14-18页 |
| ·植酸酶的研究历史 | 第14-15页 |
| ·植酸酶基因的研究进展 | 第15-16页 |
| ·植酸酶基因的表达 | 第16-17页 |
| ·植酸酶基因的突变 | 第17-18页 |
| ·毕赤酵母表达系统及影响外源蛋白表达量的因素 | 第18-20页 |
| ·植酸酶的应用 | 第20-21页 |
| ·植酸酶在动物营养中的应用 | 第20页 |
| ·植酸酶在人类营养中的应用 | 第20页 |
| ·植酸酶在合成低磷酸肌醇的应用 | 第20-21页 |
| 第2章 黑曲霉产植酸酶条件的优化 | 第21-29页 |
| ·实验材料 | 第21-22页 |
| ·菌株 | 第21页 |
| ·药品与酶 | 第21页 |
| ·培养基与主要试剂的配制 | 第21页 |
| ·主要仪器 | 第21-22页 |
| ·实验方法 | 第22-25页 |
| ·斜面培养 | 第22页 |
| ·种子摇瓶培养 | 第22页 |
| ·发酵培养 | 第22页 |
| ·酶活测定方法 | 第22-24页 |
| ·产酶条件优化 | 第24-25页 |
| ·结果与分析 | 第25-28页 |
| ·不同碳源对黑曲霉产植酸酶活力的影响 | 第25页 |
| ·不同氮源对黑曲霉产植酸酶活力的影响 | 第25-26页 |
| ·不同碳源添加量对黑曲霉产植酸酶活力的影响 | 第26-27页 |
| ·不同氮源添加量对黑曲霉产植酸酶活力的影响 | 第27页 |
| ·不同初始pH对黑曲霉产植酸酶活力的影响 | 第27-28页 |
| ·小结 | 第28-29页 |
| 第3章 黑曲霉植酸酶基因的克隆 | 第29-42页 |
| ·实验材料 | 第29-31页 |
| ·菌株及质粒 | 第29页 |
| ·药品与酶 | 第29页 |
| ·培养基与主要试剂的配制 | 第29-31页 |
| ·主要仪器 | 第31页 |
| ·实验方法 | 第31-37页 |
| ·斜面培养 | 第31页 |
| ·种子摇瓶培养 | 第31-32页 |
| ·黑曲霉基因组 DNA的提取 | 第32页 |
| ·引物设计 | 第32页 |
| ·植酸酶基因的克隆 | 第32-33页 |
| ·琼脂糖凝胶核酸电泳 | 第33页 |
| ·目的片段的回收 | 第33-34页 |
| ·DNA浓缩 | 第34页 |
| ·PCR产物的 TA克隆 | 第34页 |
| ·重组质粒转化大肠杆菌 | 第34-35页 |
| ·质粒小量提取 | 第35-36页 |
| ·重组质粒的PCR验证 | 第36-37页 |
| ·实验结果 | 第37-41页 |
| ·基因组 DNA提取 | 第37页 |
| ·全序列获得 | 第37页 |
| ·阳性克隆子的筛选与鉴定 | 第37-38页 |
| ·核苷酸序列及与同源性分析 | 第38-41页 |
| ·小结 | 第41-42页 |
| 第4章 植酸酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第42-60页 |
| ·材料与方法 | 第42-44页 |
| ·菌株及质粒 | 第42页 |
| ·药品与酶 | 第42页 |
| ·引物设计 | 第42-43页 |
| ·培养基及主要试剂配制 | 第43-44页 |
| ·实验方法 | 第44-50页 |
| ·目的基因的PCR扩增 | 第44页 |
| ·PCR扩增产物的割胶回收 | 第44页 |
| ·PCR扩增产物的双酶切 | 第44-45页 |
| ·表达载体pPICZαA的双酶切 | 第45页 |
| ·连接 | 第45页 |
| ·感受态细胞TOP10F’的制备与转化 | 第45-46页 |
| ·阳性质粒的筛选 | 第46页 |
| ·重组质粒的大量提取 | 第46-47页 |
| ·重组质粒的线性化(单酶切) | 第47页 |
| ·酵母菌株 GS115感受态细胞的制备 | 第47页 |
| ·毕赤酵母的电击转化 | 第47页 |
| ·重组子甲醇利用型的鉴定 | 第47-48页 |
| ·重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达 | 第48页 |
| ·基因工程菌产酶条件的优化 | 第48-49页 |
| ·植酸酶酶学性质的研究 | 第49-50页 |
| ·结果与分析 | 第50-59页 |
| ·植酸酶基因PhyA的PCR扩增 | 第50页 |
| ·植酸酶基因PhyA的双酶切 | 第50页 |
| ·表达载体pPICZαA的双酶切 | 第50页 |
| ·PhyA与pPICZαA表达载体的连接和阳性表达质粒的筛选 | 第50-51页 |
| ·质粒pPICZαA-PhyA的大量提取及表达载体线性化 | 第51页 |
| ·酵母的电击转化 | 第51-52页 |
| ·重组子甲醇利用型的鉴定 | 第52页 |
| ·重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达 | 第52页 |
| ·表达产物的 SDS-PAGE | 第52-53页 |
| ·重组毕赤酵母程菌的产酶条件优化 | 第53-55页 |
| ·植酸酶酶学性质的研究 | 第55-59页 |
| ·小结 | 第59-60页 |
| 第5章 植酸酶基因的定点突变 | 第60-69页 |
| ·实验材料 | 第60页 |
| ·菌株与质粒 | 第60页 |
| ·药品与酶 | 第60页 |
| ·实验方法 | 第60-64页 |
| ·毕赤酵母偏爱密码子的分析和 PhyA基因的改造 | 第60-61页 |
| ·PhyA基因定点突变 | 第61-63页 |
| ·表达质粒pPICZαA-PhyA-M3，pPICZαA-PhyA-M6的构建及线性化 | 第63页 |
| ·毕赤酵母的电击转化、重组毕赤酵母工程菌株的筛选及诱导表达 | 第63-64页 |
| ·结果与讨论 | 第64-68页 |
| ·定点突变引物设计 | 第64页 |
| ·定点突变 | 第64-65页 |
| ·定点突变测序结果分析 | 第65页 |
| ·表达质粒pPICZαA-phyA-M3，pPICZαA-phyA-M6的构建 | 第65-66页 |
| ·pPICZαA-phyA-M3，pPICZαA-phyA-M6质粒的大量提取及线性化 | 第66页 |
| ·毕赤酵母的电击转化 | 第66页 |
| ·重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达 | 第66-68页 |
| ·小结 | 第68-69页 |
| 第6章 结果与讨论 | 第69-71页 |
| ·结论 | 第69页 |
| ·下一步研究计划 | 第69-71页 |
| 参考文献 | 第71-76页 |
| 详细摘要 | 第76-78页 |
