| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 前言 | 第12-21页 |
| 一、HPV的生物学特征及致病机制 | 第12-13页 |
| 二、HPV治疗性疫苗研究现状 | 第13-14页 |
| 三、肿瘤微环境的作用机制 | 第14-15页 |
| 四、TGF-β在肿瘤中的重要作用 | 第15-16页 |
| 五、抗细胞因子主动免疫策略的应用前景 | 第16页 |
| 六、新型佐剂在提高疫苗作用中的影响 | 第16-18页 |
| 七、纳米颗粒靶向递送抗原在肿瘤治疗中的重要作用 | 第18-19页 |
| 八、研究目的及意义 | 第19-21页 |
| 第一部分 靶向TGF-β1主动免疫对HPV16病毒样颗粒治疗性疫苗作用的影响 | 第21-70页 |
| 1 引言 | 第21-23页 |
| 2 实验材料与方法 | 第23-47页 |
| 2.1 实验材料 | 第23-27页 |
| 2.1.1 质粒、菌株及细胞株 | 第23页 |
| 2.1.2 实验动物 | 第23页 |
| 2.1.3 实验试剂及耗材 | 第23-27页 |
| 2.2 实验方法 | 第27-47页 |
| 2.2.1 呈递TGF-β1_(67-75)的重组表达质粒的构建 | 第27-31页 |
| 2.2.2 重组质粒的诱导表达 | 第31页 |
| 2.2.3 硫酸铵盐析法初步纯化重组蛋白 | 第31-32页 |
| 2.2.4 蔗糖密度梯度离心纯化目的蛋白 | 第32页 |
| 2.2.5 Sephadex G25脱盐 | 第32-33页 |
| 2.2.6 BCA蛋白质定量 | 第33页 |
| 2.2.7 病毒样颗粒鉴定 | 第33-34页 |
| 2.2.8 肿瘤细胞培养 | 第34页 |
| 2.2.9 小鼠HPV16移植肿瘤模型的建立 | 第34-35页 |
| 2.2.10 皮下免疫 | 第35页 |
| 2.2.11 靶向抑制TGFβ1并结合HPV16治疗性疫苗对小鼠肿瘤模型干预实验研究 | 第35页 |
| 2.2.12 采血 | 第35-36页 |
| 2.2.13 小鼠血清IgGI、IgG2a抗体水平检测 | 第36页 |
| 2.2.14 小鼠脾脏及肿瘤组织的获取 | 第36-37页 |
| 2.2.15 体外分离小鼠脾脏组织淋巴细胞 | 第37页 |
| 2.2.16 体外分离小鼠肿瘤组织淋巴细胞 | 第37页 |
| 2.2.17 ELISA检测脾细胞刺激上清的细胞因子表达 | 第37-38页 |
| 2.2.18 ELISPOT检测分泌IFN-γ的T细胞的水平 | 第38-39页 |
| 2.2.19 流式细胞术检测CTL细胞水平 | 第39-40页 |
| 2.2.20 流式细胞术检测Th1细胞水平 | 第40-41页 |
| 2.2.21 流式细胞术检测Treg细胞水平 | 第41页 |
| 2.2.22 免疫组化 | 第41-42页 |
| 2.2.23 肿瘤组织总RNA提取 | 第42-43页 |
| 2.2.24 肿瘤组织mRNA的逆转录及qPCR检测 | 第43-45页 |
| 2.2.25 Western Blot | 第45-47页 |
| 3 结果与分析 | 第47-64页 |
| 3.1 HBcAg- TGFβ1_(67-75)重组质粒的酶切鉴定 | 第47页 |
| 3.2 重组蛋白的纯化 | 第47-48页 |
| 3.3 病毒样颗粒的鉴定 | 第48-50页 |
| 3.3.1 病毒样颗粒的HPLC分析 | 第48-49页 |
| 3.3.2 病毒样颗粒的电镜观察 | 第49-50页 |
| 3.4 TGFβ1 VLPs联合免疫HPV16治疗性疫苗对小鼠肿瘤模型的干预研究 | 第50-64页 |
| 3.4.1 HBcAg-TGFβ1_(67-75)和HBcAg-E7_(49-57) VLPs联合免疫对小鼠肿瘤生长的影响 | 第50-52页 |
| 3.4.2 HBcAg-TGFβ1_(67-75)和HBcAg-E7_(49-57) VLPs联合免疫对IgG1/IgG2a应答偏向性的影响 | 第52-53页 |
| 3.4.3 HBcAg-TGFβ1_(67-75)和HBcAg-E7_(49-57) VLPs联合免疫对细胞因子应答的影响 | 第53-54页 |
| 3.4.4 HBcAg-TGFβ1_(67-75)和HBcAg-E7_(49-57) VLPs联合免疫对分泌IFN-γ的淋巴细胞水平的影响 | 第54-55页 |
| 3.4.5 HBcAg-TGFβ1_(67-75)和HBcAg-E7_(49-57) VLPs联合免疫对脾脏Th1、CTLs效应淋巴细胞水平的影响 | 第55-56页 |
| 3.4.6 HβcAg-TGFβ1_(67-75)和HBcAg-E7_(49-57) VLPs联合免疫对脾脏组织Treg细胞水平的影响 | 第56-57页 |
| 3.4.7 HBcAg-TGFβ1_(67-75)和HBcAg-E7_(49-57) VLPs联合免疫对肿瘤组织中E7特异的CTL细胞和Treg细胞的影响 | 第57-60页 |
| 3.4.8 HBcAg-TGFβ1_(67-75)和HBcAg-E7_(49-57) VLPs联合免疫对肿瘤组织血管生成以及VEGF基因表达的影响 | 第60-61页 |
| 3.4.9 联合免疫对肿瘤微环境中相关细胞因子以及趋化因子的转录水平的影响 | 第61-62页 |
| 3.4.10 靶向TGFβ1对肿瘤组织中TGFβ1信号通路激活的影响 | 第62-64页 |
| 4 讨论 | 第64-69页 |
| 4.1 疫苗联合疗法是有效的肿瘤干预新手段 | 第64页 |
| 4.2 TGF-β1作为调控靶点并联合治疗性疫苗的潜能及安全性 | 第64-65页 |
| 4.3 应用VLP作为载体利于打破自身蛋白的免疫耐受 | 第65-66页 |
| 4.4 靶向TGF-β1并联合VLPs治疗性疫苗对小鼠肿瘤干预潜能 | 第66页 |
| 4.5 联合免疫TGF-β1 VLPs和VLPs治疗性疫苗诱导的免疫效应评价 | 第66-67页 |
| 4.6 联合免疫对肿瘤血管、相关趋化因子的影响 | 第67页 |
| 4.7 靶向TGF-β的作用机制初步评价 | 第67-69页 |
| 5 小结 | 第69-70页 |
| 第二部分 核酸免疫刺激物及纳米颗粒佐剂对HPV16 E7抗原激发的抗肿瘤免疫应答的影响 | 第70-110页 |
| 1 引言 | 第70-72页 |
| 2 实验材料与方法 | 第72-79页 |
| 2.1 实验材料 | 第72-74页 |
| 2.1.1 实验动物 | 第72页 |
| 2.1.2 实验所需抗体 | 第72页 |
| 2.1.3 实验所需主要耗材 | 第72-73页 |
| 2.1.4 实验所需主要试剂 | 第73-74页 |
| 2.1.5 实验所需主要仪器 | 第74页 |
| 2.2 实验方法 | 第74-79页 |
| 2.2.1 体外分离及培养BMDCs细胞 | 第74页 |
| 2.2.2 FITC体外标记HBcAg-E7_(49-57) VLPs | 第74-75页 |
| 2.2.3 共聚焦显微镜观察DOTAP有效促进BMDCs对HBcAg-E7_(49-57) VLPs的摄取 | 第75页 |
| 2.2.4 DOTAP有效促进BMDCs对HBcAg-E7_(49-57)VLPs的摄取效率 | 第75页 |
| 2.2.5 检测BMDCs的成熟情况 | 第75-76页 |
| 2.2.6 核酸佐剂联合应用对HBcAg-E7_(49-57) VLPs促进BMDCs的MHC-I递呈的影响 | 第76页 |
| 2.2.7 ELISA检测BMDCs刺激上清炎性细胞因子的含量 | 第76页 |
| 2.2.8 HBcAg-E7_(49-57)重组蛋白的表达纯化以及病毒样颗粒的鉴定 | 第76-77页 |
| 2.2.9 DOTAP递送核酸佐剂对HBcAg-E7_(49-57) VLPs免疫干预的影响 | 第77页 |
| 2.2.10 ELISPOT检测分泌IFN-γ的脾脏淋巴细胞水平 | 第77页 |
| 2.2.11 流式细胞术检测细胞表面标记 | 第77页 |
| 2.2.12 包裹抗原及核酸佐剂的纳米颗粒的制备 | 第77-78页 |
| 2.2.13 包裹抗原的纳米粒的电镜观察以及粒径分析 | 第78-79页 |
| 3 实验结果 | 第79-104页 |
| 3.1 CpG、PolyI:C的协同作用对E7特异的抗肿瘤免疫应答的影响 | 第79-84页 |
| 3.1.1 CpG和PolyI:C作为佐剂的协同效应对小鼠肿瘤生长的影响 | 第79-80页 |
| 3.1.2 CpG和PolyI:C作为佐剂的协同效应对E7特异的抗肿瘤免疫应答的影响 | 第80-84页 |
| 3.2 DOTAP阳离子脂质体递送核酸佐剂对HBcAg-E7_(49-57)VLPs抗肿瘤作用的影响 | 第84-93页 |
| 3.2.1 体外培养BMDCs的纯度测定 | 第84-85页 |
| 3.2.2 DOTAP对BMDCs摄取HBcAg-E7_(49-57) VLPs效率的影响 | 第85页 |
| 3.2.3 DOTAP对HBcAg-E7_(49-57) VLPs促进BMDCs成熟的影响 | 第85-86页 |
| 3.2.4 核酸佐剂联合应用对HBcAg-E7_(49-57) VLPs促进BMDCs的MHC-I递呈的影响 | 第86-87页 |
| 3.2.5 DOTAP递送核酸佐剂以及HBcAg-E7_(49-57) VLPs对小鼠肿瘤生长的影响 | 第87-88页 |
| 3.2.6 DOTAP递送核酸佐剂以及HBcAg-E7_(49-57) VLPs对分泌IFN-γ的淋巴细胞水平的影响 | 第88-89页 |
| 3.2.7 DOTAP递送核酸佐剂以及HBcAg-E7_(49-57) VLPs对Th1/CTLs淋巴细胞水平的影响 | 第89-91页 |
| 3.2.8 DOTAP递送核酸佐剂以及HBcAg-E7_(49-57) VLPs对免疫抑制细胞水平的影响 | 第91-92页 |
| 3.2.9 DOTAP递送核酸佐剂以及HBcAg-E7_(49-57) VLPs对记忆T细胞水平的影响 | 第92-93页 |
| 3.3 新型纳米颗粒靶向递送核酸佐剂对E7特异的抗肿瘤免疫应答的影响 | 第93-104页 |
| 3.3.1 含不同组分的纳米颗粒的性质鉴定 | 第93-94页 |
| 3.3.2 纳米颗粒递送核酸佐剂促BMDCs成熟的作用 | 第94-96页 |
| 3.3.3 纳米颗粒递送核酸佐剂促进BMDCs分泌促炎性细胞因子 | 第96-97页 |
| 3.3.4 预防性策略检测纳米颗粒递送核酸佐剂对小鼠肿瘤生长的影响 | 第97-98页 |
| 3.3.5 预防性策略检测纳米颗粒递送核酸佐剂对小鼠抗肿瘤免疫应答的影响 | 第98-100页 |
| 3.3.6 治疗性策略检测纳米颗粒递送核酸佐剂对小鼠肿瘤生长的影响 | 第100-101页 |
| 3.3.7 治疗性策略检测纳米颗粒递送核酸佐剂对小鼠抗肿瘤免疫应答的影响 | 第101-104页 |
| 4 讨论 | 第104-108页 |
| 4.1 核酸佐剂对免疫系统的影响 | 第104页 |
| 4.2 树突状细胞对抗肿瘤免疫应答的影响 | 第104-105页 |
| 4.3 核酸佐剂协同作用以及纳米颗粒递送系统的应用对治疗性疫苗的抗肿瘤干预潜能的影响 | 第105-106页 |
| 4.4 核酸佐剂协同作用以及纳米颗粒递送系统的应用对抗肿瘤免疫应答的影响 | 第106-108页 |
| 5 小结 | 第108-110页 |
| 5.1 CpG、PolyI:C的协同作用对E7特异的抗肿瘤免疫应答的影响 | 第108页 |
| 5.2 DOTAP阳离子脂质体递送核酸佐剂对HBcAg-E7_(49-57) VLPs抗肿瘤作用的影响 | 第108页 |
| 5.3 纳米材料靶向递送核酸佐剂对E7特异的抗肿瘤免疫应答的影响 | 第108-110页 |
| 展望 | 第110-111页 |
| 参考文献 | 第111-118页 |
| 附录 | 第118-124页 |
| 附录Ⅰ 英文缩写词 | 第118-120页 |
| 附录Ⅱ 主要溶液的配制 | 第120-124页 |
| 致谢 | 第124-125页 |
| 个人简历 | 第125-129页 |
