| 摘要 | 第1-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 英文缩略表 | 第12-13页 |
| 第一章 前言 | 第13-29页 |
| 1 FAT-1基因简介 | 第13-20页 |
| ·fat-1基因结构与来源 | 第13页 |
| ·fat-1基因编码的ω-3PUFAs脱氢酶 | 第13-15页 |
| ·ω-3PUFAs的研究 | 第15-20页 |
| ·ω-3PUFAs的研究背景 | 第15页 |
| ·ω-3PUFAs分类及其来源 | 第15-16页 |
| ·ω-3PUFAs的生物学功能 | 第16-17页 |
| ·在癌症方面的应用 | 第17-18页 |
| ·在心血管疾病方面的应用 | 第18页 |
| ·在神经系统方面的应用 | 第18-19页 |
| ·在视力、炎症等其它疾病方面的应用 | 第19页 |
| ·在营养方面的应用 | 第19-20页 |
| ·展望 | 第20页 |
| 2 外源基因真核表达体系的研究 | 第20-23页 |
| ·表达载体 | 第21-22页 |
| ·真核表达体系 | 第22-23页 |
| ·酵母表达系统 | 第22-23页 |
| ·昆虫杆状病毒表达系统 | 第23页 |
| ·哺乳动物细胞表达系统 | 第23页 |
| 3 转基因动物的研究 | 第23-28页 |
| ·体细胞核移植技术在转基因动物中的应用 | 第24-25页 |
| ·转基因动物的应用 | 第25-27页 |
| ·农牧业领域 | 第25页 |
| ·医学领域 | 第25-26页 |
| ·作为动物生物反应器 | 第26-27页 |
| ·动物保护 | 第27页 |
| ·绿色荧光蛋白在转基因动物中的应用 | 第27-28页 |
| 4 本课题研究的目的和意义 | 第28-29页 |
| 第二章 fat-1基因的克隆与序列分析 | 第29-48页 |
| 1 克隆策略 | 第29-30页 |
| 2 实验材料 | 第30-32页 |
| ·实验动物 | 第30页 |
| ·菌株和载体 | 第30页 |
| ·主要试剂和工具酶 | 第30页 |
| ·DNA分析软件及数据库 | 第30页 |
| ·主要溶液的配制 | 第30-31页 |
| ·仪器设备 | 第31-32页 |
| 3 实验方法 | 第32-37页 |
| ·引物设计与合成 | 第32页 |
| ·秀丽隐杆线虫总RNA提取 | 第32页 |
| ·秀丽隐杆线虫fat-1基因第一链cDNA的合成 | 第32-33页 |
| ·秀丽隐杆线虫fat-1基因的PCR扩增 | 第33页 |
| ·秀丽隐杆线虫fat-1基因的优化与合成 | 第33页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第33页 |
| ·目的片段的回收纯化 | 第33-34页 |
| ·DNA片段与载体连接 | 第34页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞制备(CaCl_2法) | 第34-35页 |
| ·热激转化 | 第35页 |
| ·重组质粒筛选 | 第35页 |
| ·菌液PCR筛选阳性克隆 | 第35页 |
| ·质粒DNA的小量提取 | 第35页 |
| ·克隆载体的酶切鉴定 | 第35-36页 |
| ·DNA测序鉴定 | 第36页 |
| ·菌种的保存于复苏 | 第36-37页 |
| 4 实验结果 | 第37-45页 |
| ·秀丽隐杆线虫fat-1基因的优化与合成 | 第37-39页 |
| ·C.elegans总RNA的电泳结果 | 第39-40页 |
| ·fat-1基因的RT-PCR扩增结果 | 第40页 |
| ·菌液PCR筛选阳性结果 | 第40页 |
| ·克隆质粒pGEM-fat-1和pUC-opfat-1的双酶切鉴定 | 第40-41页 |
| ·克隆质粒序列测定结果 | 第41-45页 |
| 5 讨论 | 第45-48页 |
| ·目的基因的选择和优化 | 第45-46页 |
| ·特异性引物的设计 | 第46页 |
| ·阳性克隆的筛选与鉴定 | 第46页 |
| ·fat-1基因的PCR扩增、连接、酶切与测序结果 | 第46-48页 |
| 第三章 fat-1基因家兔表达载体的构建 | 第48-56页 |
| 1 表达载体PEGFP-FAT-1构建示意图 | 第48-49页 |
| 2 实验材料 | 第49-50页 |
| ·质粒和菌种 | 第49页 |
| ·主要试剂和工具酶 | 第49页 |
| ·DNA分析软件及数据库 | 第49页 |
| ·主要溶液的配制 | 第49-50页 |
| ·仪器设备 | 第50页 |
| 3 实验方法 | 第50-52页 |
| ·引物合成 | 第50页 |
| ·DNA的常规操作 | 第50页 |
| ·氯化镁法转化绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1 | 第50-51页 |
| ·质粒抽提筛选阳性重组克隆 | 第51页 |
| ·重组表达质粒的构建 | 第51页 |
| ·克隆质粒pGEM-fat-1、pUC-opfat-1与pEGFP-C1载体双酶切产物的纯化回收 | 第51页 |
| ·目的片段与载体片段连接 | 第51页 |
| ·连接产物转化 | 第51页 |
| ·重组表达质粒筛选阳性克隆 | 第51页 |
| ·重组表达质粒的菌液PCR鉴定 | 第51-52页 |
| ·质粒DNA的小量提取 | 第52页 |
| ·重组表达质粒的双酶切鉴定 | 第52页 |
| ·DNA测序鉴定 | 第52页 |
| 4 实验结果 | 第52-55页 |
| ·重组表达载体的菌液PCR筛选结果 | 第52-53页 |
| ·重组表达载体的双酶切鉴定 | 第53页 |
| ·重组表达载体的测序结果 | 第53-55页 |
| 5 讨论 | 第55-56页 |
| ·绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的选择 | 第55页 |
| ·构建的重组表达载体测序结果分析 | 第55-56页 |
| 第四章 fat-1基因在家兔胎儿成纤维细胞中的表达 | 第56-71页 |
| 1 实验材料 | 第56-57页 |
| ·实验动物 | 第56页 |
| ·质粒 | 第56页 |
| ·主要试剂和工具酶 | 第56页 |
| ·主要溶液的配制 | 第56-57页 |
| ·仪器设备 | 第57页 |
| 2 实验方法 | 第57-63页 |
| ·家兔胎儿成纤维细胞的培养 | 第57-58页 |
| ·原代培养 | 第57页 |
| ·传代培养 | 第57-58页 |
| ·细胞冻存与复苏 | 第58页 |
| ·细胞计数 | 第58页 |
| ·生长曲线绘制 | 第58-59页 |
| ·活细胞的测定 | 第59页 |
| ·G418毒性敏感实验 | 第59页 |
| ·脂质体介导的外源基因转染 | 第59-61页 |
| ·无内毒素质粒大量提取 | 第59-60页 |
| ·脂质体介导法瞬时转染家兔胎儿成纤维细胞条件的优化 | 第60-61页 |
| ·转染效率的测定 | 第61页 |
| ·转染后阳性细胞克隆的筛选 | 第61页 |
| ·转fat-1基因家兔胎儿成纤维细胞的检测 | 第61-63页 |
| ·DNA水平对转基因细胞的检测 | 第61-62页 |
| ·细胞基因组提取 | 第61-62页 |
| ·基因组PCR检测 | 第62页 |
| ·RNA水平对转基因细胞的检测 | 第62-63页 |
| ·转基因细胞RNA提取 | 第62-63页 |
| ·RT-PCR检测 | 第63页 |
| 3 实验结果 | 第63-68页 |
| ·家兔胎儿成纤维细胞形态观察 | 第63-64页 |
| ·家兔胎儿成纤维细胞生长曲线的绘制 | 第64-65页 |
| ·家兔胎儿成纤维细胞的G418毒性敏感实验 | 第65-66页 |
| ·转染细胞的的荧光检测及转染效率 | 第66页 |
| ·阳性细胞克隆的获得 | 第66-67页 |
| ·DNA水平对转基因细胞的检测 | 第67-68页 |
| ·RNA水平对转基因细胞的检测 | 第68页 |
| 4 讨论 | 第68-71页 |
| 小结 | 第71-72页 |
| 创新点 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-80页 |
| 致谢 | 第80页 |
