| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第一章 引言 | 第11-22页 |
| 1.1 染色质与核小体 | 第11-12页 |
| 1.2 核小体的作用 | 第12-13页 |
| 1.3 组蛋白及相关修饰 | 第13-14页 |
| 1.4 内含子的识别剪切 | 第14-15页 |
| 1.5 调节染色质状态的主要机制 | 第15页 |
| 1.6 核小体排布的测定及预测 | 第15-17页 |
| 1.6.1 核小体排布的测定方法 | 第15-16页 |
| 1.6.2 核小体排布的预测 | 第16-17页 |
| 1.7 染色质结构、核小体、内含子剪切三者的关系 | 第17页 |
| 1.8 本课题研究的依据及意义 | 第17-22页 |
| 第二章 材料与方法 | 第22-44页 |
| 2.1 实验材料 | 第22-30页 |
| 2.1.1 质粒 | 第22-24页 |
| 2.1.2 菌种 | 第24页 |
| 2.1.3 酶、化学药品及试剂 | 第24-25页 |
| 2.1.4 所用仪器及设备 | 第25-26页 |
| 2.1.5 常用培养基的制备 | 第26-28页 |
| 2.1.5.1 用于培养大肠杆菌的培养基 | 第26页 |
| 2.1.5.2 用于培养酵母菌培养基 | 第26-28页 |
| 2.1.6 试剂的配制 | 第28-30页 |
| 2.1.6.2 用于酵母基因组DNA抽提的相关缓冲液 | 第28页 |
| 2.1.6.3 酵母RNA抽提及电泳相关缓冲液 | 第28-29页 |
| 2.1.6.4 Northern blot杂交相关缓冲液 | 第29-30页 |
| 2.1.7 抗体 | 第30页 |
| 2.2 实验方法 | 第30-44页 |
| 2.2.1 生物学软件及数据分析 | 第30页 |
| 2.2.2 酵母基因组DNA的抽提 | 第30-31页 |
| 2.2.3 在Arab RPL36B基因不同位置插入内含子的方法 | 第31-32页 |
| 2.2.3.1 在Arab RPL36B基因不同位置插入内含子的策略 | 第31-32页 |
| 2.2.3.2 用PCR法在Arab RPL36B基因不同位置插入内含子的步骤 | 第32页 |
| 2.2.5 Touchdown PCR反应体系 | 第32-33页 |
| 2.2.6 PCR产物的检测 | 第33页 |
| 2.2.7 PCR产物回收与纯化 | 第33-34页 |
| 2.2.7.1 PCR产物回收与纯化 | 第33-34页 |
| 2.2.7.2 PCR产物凝胶纯化回收 | 第34页 |
| 2.2.8 酶切体系(NEB) | 第34-35页 |
| 2.2.9 酶切产物纯化回收 | 第35页 |
| 2.2.10 目的片段酶切产物与载体的酶连体系(TaKaRa) | 第35页 |
| 2.2.11 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备和转化 | 第35-36页 |
| 2.2.11.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 | 第35页 |
| 2.2.11.2 大肠杆菌转化 | 第35-36页 |
| 2.2.12 菌落PCR验证转化结果 | 第36-37页 |
| 2.2.12.1 大肠杆菌落PCR | 第36页 |
| 2.2.12.2 大肠杆菌落PCR产物的检测 | 第36-37页 |
| 2.2.13 大肠杆菌质粒抽提及酶切验证 | 第37-38页 |
| 2.2.13.1 大肠杆菌质粒抽提 | 第37页 |
| 2.2.13.2 克隆构建质粒的酶切验证(TaKaRa) | 第37-38页 |
| 2.2.14 酵母电转化 | 第38-39页 |
| 2.2.16 酵母总RNA抽提 | 第39-40页 |
| 2.2.17 RNA变性电泳 | 第40页 |
| 2.2.17.1 FA RNA琼脂糖凝胶的配制 | 第40页 |
| 2.2.17.2 RNA样品的处理 | 第40页 |
| 2.2.17.3 RNA电泳条件 | 第40页 |
| 2.2.18 RT-PCR | 第40-41页 |
| 2.2.20 Western blot | 第41-44页 |
| 2.2.20.1 酵母总蛋白的提取 | 第41-42页 |
| 2.2.20.2 SDS-PAGE | 第42页 |
| 2.2.20.3 转膜 | 第42-43页 |
| 2.2.20.4 封闭及抗体的孵育 | 第43-44页 |
| 第三章 实验结果与分析 | 第44-59页 |
| 3.1 分析酵母内含子的特征 | 第44-46页 |
| 3.1.1 对于酵母有内含子基因的数量及占基因总数比例的分析 | 第44-45页 |
| 3.1.2 针对酵母内含子长度与相对位置的分析 | 第45-46页 |
| 3.2 通过在目的基因不同位置插入酵母内含子,探索酵母剪切多个内含子时其效率如何 | 第46-52页 |
| 3.2.1 在Arab RPL36B报告基因不同位置插入酵母内含子的克隆结果 | 第47-49页 |
| 3.2.2 在拟南芥RPL36B报告基因不同位置插入酵母内含子克隆的实验检测结果及分析 | 第49-50页 |
| 3.2.3 将目的基因导入酵母内源RPL36B染色体位置进行表达 | 第50-52页 |
| 3.3 通过改变目的基因的启动子,研究启动子对目的基因内含子剪切和表达的影响 | 第52-56页 |
| 3.3.1 将目的基因转入敲除酵母内源RPL36B菌株,观察转入拟南芥蛋白后菌株的生长缓解程度 | 第53-55页 |
| 3.3.2 将目的基因启动子换为ADH1基因启动子,验证不同启动子对目的基因内含子剪切的影响 | 第55-56页 |
| 3.4 探索除传统剪切因子外参与调节内含子识别与剪切的基因 | 第56-59页 |
| 3.4.1 目的基因转入△XRN1 (BY4741)菌株后各个内含子的剪切情况 | 第56-57页 |
| 3.4.2 在细胞内过表达组蛋白H1 (HHT1)后对内含子剪切的影响 | 第57-59页 |
| 第四章 讨论与展望 | 第59-61页 |
| 致谢 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-66页 |
| 附录 | 第66-71页 |
| 所用到的拟南芥基因和酵母内含子序列 | 第66-67页 |
| 关于SPT7基因插入LacZ6片段的实验结果 | 第67-68页 |
| 关于FPR1基因插入LacZ6片段的实验结果 | 第68-70页 |
| 关于在拟南芥RPL36B、酵母RPL36A和RPL36B基因3’UTR区域插入6×MS2片段的实验结果 | 第70-71页 |
