| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 缩略表 | 第14-19页 |
| 第一章 绪言 | 第19-38页 |
| 1.1 c-FLIP简介 | 第23-27页 |
| 1.1.1 c-FLIP的发现 | 第23页 |
| 1.1.2 c-FLIP的结构 | 第23-25页 |
| 1.1.3 c-FLIP的功能 | 第25-27页 |
| 1.2 RNA干扰(RNAi) | 第27-29页 |
| 1.2.1 RNAi的发现与siRNA简述 | 第27-28页 |
| 1.2.2 RNAi机制 | 第28-29页 |
| 1.3 靶向c-FLIP的siRNA应用于癌细胞凋亡 | 第29-36页 |
| 1.3.1 c-FLIP过表达与细胞凋亡 | 第29-30页 |
| 1.3.2 靶向c-FLIP的siRNA促进细胞凋亡以及siRNA的条件优化 | 第30-35页 |
| 1.3.3 c-FLIP的siRNA协同其他蛋白促进细胞凋亡 | 第35页 |
| 1.3.4 c-FLIP的siRNA传递方法优化并联合其他抗癌药物促进细胞凋亡 | 第35-36页 |
| 1.4 本课题研究的目的及意义 | 第36-38页 |
| 第二章 稳定细胞系的构建 | 第38-61页 |
| 2.1 实验材料与仪器 | 第38-42页 |
| 2.1.1 材料 | 第38-39页 |
| 2.1.1.1 细胞、菌种和细胞系 | 第38页 |
| 2.1.1.2 主要试剂和药品 | 第38-39页 |
| 2.1.2 主要仪器 | 第39-41页 |
| 2.1.3 AT406与Rocaglamide化学结构分析 | 第41-42页 |
| 2.1.3.1 AT406简介 | 第41页 |
| 2.1.3.2 Rocaglamide简介 | 第41-42页 |
| 2.2 实验溶液及其配制 | 第42-45页 |
| 2.3 实验方法及结果 | 第45-61页 |
| 2.3.1 人类骨肉瘤细胞系U2OS的培养 | 第45-46页 |
| 2.3.1.1 人类骨肉瘤细胞系U2OS的来源 | 第45页 |
| 2.3.1.2 人类骨肉瘤细胞系U2OS的培养 | 第45-46页 |
| 2.3.1.3 人类骨肉瘤细胞系U2OS的冻存 | 第46页 |
| 2.3.2 真核表达载体pSUPER-c-FLIP-siRNA的构建 | 第46-53页 |
| 2.3.2.1 靶向c-FLIP cDNA序列的siRNA序列来源 | 第46-47页 |
| 2.3.2.2 在NCBI上查找c-FLIP cDNA序列,并与siRNA序列比对 | 第47页 |
| 2.3.2.3 将靶向c-FLIP cDNA的siRNA序列连接到载体pSUPER.puro | 第47-53页 |
| 2.3.3 质粒pSUPER-c-FLIP-siRNA转染U2OS细胞 | 第53-56页 |
| 2.3.3.1 U2OS细胞培养 | 第53页 |
| 2.3.3.2 U2OS细胞冻存 | 第53-54页 |
| 2.3.3.3 FuGENE-HD转染试剂转染U2OS效率测试 | 第54-55页 |
| 2.3.3.4 质粒pSUPER-c-FLIP-siRNA和pSUPER.puro DNA转染入U2OS细胞 | 第55页 |
| 2.3.3.5 siRNA在细胞内的产生过程 | 第55-56页 |
| 2.3.4 筛选稳定细胞株 | 第56-61页 |
| 2.3.4.1 Puromycin作用下U2OS生存曲线制作 | 第56-57页 |
| 2.3.4.2 在上述转染48小时的细胞中加入上述测定的最佳筛选浓度为1μg/ml的Puromycin筛选克隆细胞 | 第57-59页 |
| 2.3.4.3 筛选结果如下图 | 第59页 |
| 2.3.4.4 扩大培养克隆得到的稳转细胞 | 第59-60页 |
| 2.3.4.5 稳转细胞的冻存 | 第60-61页 |
| 第三章 稳转克隆的验证 | 第61-82页 |
| 3.1 材料和方法 | 第61-65页 |
| 3.1.1 材料 | 第61-63页 |
| 3.1.1.1 细胞、菌种和载体 | 第61页 |
| 3.1.1.2 主要的试剂及药品 | 第61-63页 |
| 3.1.2 主要仪器 | 第63-65页 |
| 3.2 主要溶液及配制 | 第65-68页 |
| 3.3 实验方法与结果 | 第68-82页 |
| 3.3.1 两种克隆细胞U2OS/pSUPER-c-FLIP-siRNA和U2OS/pSUPER的培养 | 第68页 |
| 3.3.2 克隆细胞U2OS/pSUPER-c-FLIP-siRNA和U2OS/pSUPER中c-FLIP mRNA水平检测 | 第68-72页 |
| 3.3.2.1 反转录引物的稀释 | 第68-69页 |
| 3.3.2.2 两种克隆细胞U20S/pSUPER-c-FLIP-siRNA和U2OS/pSUPER总RNA的提取 | 第69页 |
| 3.3.2.3 逆转录反应 | 第69-70页 |
| 3.3.2.4 PCR反应 | 第70-71页 |
| 3.3.2.5 数据处理结果 | 第71-72页 |
| 3.3.3 MTT检测与对照细胞U2OS/pSUPER相比,实验组细胞U2OS/pSUPER-c-FLIP-siRNA对TRAIL敏感性是否增强 | 第72-73页 |
| 3.3.3.1 MTT检测细胞凋亡 | 第72-73页 |
| 3.3.3.2 数据处理结果 | 第73页 |
| 3.3.4 Western blot检测U2OS/pSUPER、U2OS/pSUPER-c-FLIP-siRNA两种细胞中c-FLIP蛋白的表达 | 第73-78页 |
| 3.3.4.1 制备细胞裂解液 | 第73-74页 |
| 3.3.4.2 蛋白定量及样品准备 | 第74-76页 |
| 3.3.4.3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第76-77页 |
| 3.3.4.4 免疫印迹 | 第77-78页 |
| 3.3.4.5 WB检测结果及分析 | 第78页 |
| 3.3.5 流式细胞术分析U2OS/pSUPER和U2OS/pSUPER-c-FLIP-siRNA细胞凋亡过程 | 第78-81页 |
| 3.3.5.1 流式细胞术过程 | 第78-80页 |
| 3.3.5.2 实验结果及分析 | 第80-81页 |
| 3.3.6 实验结果数据分析 | 第81-82页 |
| 第四章 讨论 | 第82-85页 |
| 致谢 | 第85-87页 |
| 参考文献 | 第87-95页 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 | 第95-96页 |
| 附录B 其他需要说明的内容 | 第96页 |
