| 中文摘要 | 第3-7页 |
| Abstract | 第7-11页 |
| 缩略词表 | 第12-18页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-29页 |
| 1 lncRNA参与细胞分化调控方式的研究进展 | 第18-20页 |
| 1.1 通过与microRNA互作参与细胞分化 | 第18页 |
| 1.2 通过招募蛋白形成复合物,发挥支架作用,参与细胞分化 | 第18-19页 |
| 1.3 通过对转录因子的诱饵作用参与细胞分化 | 第19-20页 |
| 2 lncRNA在不同物种中调控机制的研究进展 | 第20-22页 |
| 2.1 lncRNA在果蝇中调控机制的研究进展 | 第20-21页 |
| 2.2 lncRNA在哺乳动物中调控机制的研究进展 | 第21-22页 |
| 2.3 lncRNA在禽类调控方式的研究展望 | 第22页 |
| 3 本研究的目的和意义 | 第22-23页 |
| 4 参考文献 | 第23-29页 |
| 第二章 ESCs向PGCs和SSCs分化过程的lncRNA测序分析 | 第29-63页 |
| 1 材料与方法 | 第29-37页 |
| 1.1 实验材料 | 第29页 |
| 1.2 试剂 | 第29页 |
| 1.3 主要仪器和设备 | 第29-30页 |
| 1.4 实验方法 | 第30-37页 |
| 1.4.1 细胞分离纯化 | 第30-31页 |
| 1.4.2 细胞扩增 | 第31页 |
| 1.4.3 转录组测序 | 第31-32页 |
| 1.4.4 RNA-seq数据分析流程 | 第32-35页 |
| 1.4.5 测序数据的荧光定量PCR验证 | 第35-37页 |
| 2 结果 | 第37-59页 |
| 2.1 细胞培养 | 第37页 |
| 2.2 样本扩增结果 | 第37-38页 |
| 2.3 测序数据过滤 | 第38-39页 |
| 2.4 参考序列的比对分析 | 第39-40页 |
| 2.5 RNA-seq整体质量评估 | 第40-41页 |
| 2.6 lncRNA的鉴定与分析 | 第41-44页 |
| 2.6.1 lncRNA的逐步筛选 | 第41-42页 |
| 2.6.2 编码潜能筛选 | 第42-44页 |
| 2.7 差异lncRNA的筛选 | 第44-48页 |
| 2.7.1 ESCs vs PGCs组 | 第44-46页 |
| 2.7.2 ESCs vs SSCs组 | 第46-47页 |
| 2.7.3 PGCs vs SSCs组 | 第47-48页 |
| 2.8 差异lncRNA表达GO分析 | 第48-53页 |
| 2.8.1 ESCs vs PGCs组 | 第48-50页 |
| 2.8.2 ESCs vs SSCs组 | 第50-52页 |
| 2.8.3 PGCs vs SSCs组 | 第52-53页 |
| 2.9 差异lncRNA表达KEGG分析 | 第53-57页 |
| 2.9.1 ESCs vs PGCs组 | 第53-55页 |
| 2.9.2 ESCs vs SSCs组 | 第55-56页 |
| 2.9.3 PGCs vs SSCs组 | 第56-57页 |
| 2.10 荧光定量PCR验证 | 第57-59页 |
| 3 讨论 | 第59-60页 |
| 4 本章小结 | 第60页 |
| 5 参考文献 | 第60-63页 |
| 第三章 PGClnc 1特异性筛选以及编码小肽的研究 | 第63-86页 |
| 1 材料与方法 | 第63-71页 |
| 1.1 实验材料 | 第63页 |
| 1.2 实验方法 | 第63-71页 |
| 1.2.1 特异表达lncRNA数据分析 | 第63-64页 |
| 1.2.2 核质分离 | 第64页 |
| 1.2.3 qRT-PCR检测 | 第64-65页 |
| 1.2.4 PGClnc1开放阅读框(ORF)的预测分析 | 第65页 |
| 1.2.5 鸡PGClnc1原核表达载体pET-28a(+)-PGClnc1的构建与鉴定 | 第65-70页 |
| 1.2.6 质粒pET-28a(+)-PGClnc1的诱导表达(表达菌株的筛选和目的蛋白的诱导表达) | 第70页 |
| 1.2.7 细菌蛋白的提取 | 第70页 |
| 1.2.8 SDS-PAGE电泳 | 第70-71页 |
| 2 结果 | 第71-83页 |
| 2.1 筛选特异表达lncRNA,以及PGClnc1的挖掘 | 第71-78页 |
| 2.1.1 组间差异lncRNA韦恩分析 | 第71-72页 |
| 2.1.2 特异表达lncRNA的GO和pathway分析 | 第72-76页 |
| 2.1.3 PGClnc1的挖掘 | 第76-78页 |
| 2.2 PGClnc1的组织特异性以及细胞定位 | 第78-80页 |
| 2.2.1 PGClnc1组织特异性 | 第78-79页 |
| 2.2.2 PGClnc1的细胞定位 | 第79-80页 |
| 2.3 编码小肽机制的研究 | 第80-83页 |
| 2.3.1 PGClnc1的重组表达质粒pET28a(+)的构建 | 第80-81页 |
| 2.3.2 PGClnc1的原核融合表达载体诱导蛋白表达 | 第81-83页 |
| 3 讨论 | 第83-84页 |
| 4 本章小结 | 第84页 |
| 5 参考文献 | 第84-86页 |
| 第四章 启动子调节PGClnc1差异表达 | 第86-107页 |
| 1 材料与方法 | 第86-95页 |
| 1.1 实验材料和试剂 | 第86页 |
| 1.1.1 实验材料 | 第86页 |
| 1.1.2 实验试剂 | 第86页 |
| 1.2 实验方法 | 第86-95页 |
| 1.2.1 PGClnc1启动子区域的生物学信息学分析 | 第86-88页 |
| 1.2.2 鸡胚全基因组的提取 | 第88页 |
| 1.2.3 真核表达载体pPGClnc1-EGFP的构建 | 第88-90页 |
| 1.2.4 鸡PGClnc1启动子活性定性分析 | 第90-91页 |
| 1.2.5 鸡PGClnc1核心启动子区域的鉴定 | 第91-93页 |
| 1.2.6 鸡PGClnc1核心启动子区域调控元件的分析 | 第93-95页 |
| 1.2.7 鸡PGClnc1基因核心启动子DNA甲基化和组蛋白乙酰化分析 | 第95页 |
| 2 实验结果 | 第95-103页 |
| 2.1 真核表达载体pPGClnc1-EGFP的构建 | 第95-96页 |
| 2.2 PGClnc1启动子活性定性分析 | 第96-97页 |
| 2.3 PGClnc1启动子各缺失克隆载体的构建 | 第97-98页 |
| 2.4 PGClnc1启动子活性分析 | 第98-99页 |
| 2.5 转录因子调节PGClnc1启动子活性 | 第99-102页 |
| 2.5.1 PGClnc1启动子核心区域转录因子结合位点预测及点突变 | 第99-100页 |
| 2.5.2 转录因子调节PGClnc1启动子启动活性 | 第100-102页 |
| 2.6 PGClnc1启动子DNA甲基化和组蛋白乙酰化分析 | 第102-103页 |
| 3 讨论 | 第103-104页 |
| 4 本章小结 | 第104-105页 |
| 5 参考文献 | 第105-107页 |
| 第五章 PGClnc1调控鸡PGCs生成的功能研究 | 第107-128页 |
| 1 材料与方法 | 第107-113页 |
| 1.1 实验材料与试剂 | 第107-108页 |
| 1.1.1 实验材料 | 第107页 |
| 1.1.2 实验试剂 | 第107-108页 |
| 1.2 实验方法 | 第108-113页 |
| 1.2.1 PGClnc1慢病毒干扰载体构建及慢病毒包裹 | 第108-109页 |
| 1.2.2 慢病毒干扰载体干扰活性检测 | 第109页 |
| 1.2.3 ESCs的分离培养与鉴定 | 第109页 |
| 1.2.4 体外诱导检测 | 第109-111页 |
| 1.2.5 体内鸡胚慢病毒注射 | 第111-113页 |
| 1.2.6 统计分析 | 第113页 |
| 2 实验结果 | 第113-125页 |
| 2.1 慢病毒RNA干扰质粒PGClnc1-shRNA和阴性对照质粒的构建 | 第113页 |
| 2.2 慢病毒干扰载体干扰活性检测 | 第113-115页 |
| 2.3 体外诱导检测 | 第115-120页 |
| 2.3.1 ESCs形态变化观察 | 第115-116页 |
| 2.3.2 体外PGCs生成效率检测 | 第116-120页 |
| 2.4 体内鸡胚慢病毒注射 | 第120-125页 |
| 2.4.1 慢病毒整合鸡胚基因组检测 | 第120-121页 |
| 2.4.2 PGCs生成效率检测 | 第121-125页 |
| 3 讨论 | 第125页 |
| 4 本章小结 | 第125-126页 |
| 5 参考文献 | 第126-128页 |
| 第六章 PGClnc1调节PGCs形成过程中的分子调控机制探究 | 第128-158页 |
| 1 材料与方法 | 第128-144页 |
| 1.1 实验材料 | 第128页 |
| 1.2 实验方法 | 第128-144页 |
| 1.2.1 PGClnc1的RNA获取 | 第128-130页 |
| 1.2.2 RNA pull-down | 第130-131页 |
| 1.2.3 蛋白质银染 | 第131页 |
| 1.2.4 RNA pull down获得蛋白鉴定 | 第131-132页 |
| 1.2.5 互作蛋白GAPDH磷酸化位点预测 | 第132页 |
| 1.2.6 RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP) | 第132-135页 |
| 1.2.7 荧光定量PCR检测TGF-β信号通路关键节点基因表达 | 第135-136页 |
| 1.2.8 SDS-PAGE电泳检测TGF-β信号通路关键节点基因蛋白表达 | 第136页 |
| 1.2.9 生物信息分析与靶基因具有结合靶点的miRNA | 第136页 |
| 1.2.10 结合miRNA测序结果分析得到与PGClnc1具有结合靶点的miRNA | 第136-137页 |
| 1.2.11 对PGClnc1与靶基因的公共靶点miRNA分析 | 第137页 |
| 1.2.12 miRNA-Inhibitor载体的构建 | 第137-139页 |
| 1.2.13 miRNA-mim载体的构建 | 第139-143页 |
| 1.2.14 DF-1细胞的培养 | 第143页 |
| 1.2.15 miRNA-mim、miRNA-Inhibitor分别与PGClnc1与BTRC的过表达、干扰载体共转染DF-1细胞 | 第143页 |
| 1.2.16 qRT-PCR检测miRNA以及PGClnc1和BTRC的表达变化 | 第143-144页 |
| 2 结果 | 第144-153页 |
| 2.1 PGClnc1的sense和antisense链体外模板获得 | 第144页 |
| 2.2 PGClnc1 RNA pull down以及质谱分析 | 第144-146页 |
| 2.3 磷酸化位点预测 | 第146页 |
| 2.4 结合RIP实验探究PGClnc1与互作蛋白结合方式 | 第146-147页 |
| 2.5 PGClnc1与互作蛋白相关信号通路调控关系初步验证 | 第147-149页 |
| 2.6 PGClnc1与BTRC的结合miRNA分析 | 第149-150页 |
| 2.7 PGClnc1竞争调节机制研究 | 第150-152页 |
| 2.8 PGClnc1与gga-mir-6577-5p竞争结合机制及互作蛋白调控PGCs形成的作用模式图 | 第152-153页 |
| 3 讨论 | 第153-155页 |
| 4 本章小结 | 第155页 |
| 5 参考文献 | 第155-158页 |
| 本文结论与创新 | 第158-161页 |
| 本文结论 | 第158-160页 |
| 全文创新点 | 第160-161页 |
| 致谢 | 第161-162页 |
| 攻读学位期间发表的论文 | 第162-163页 |
