| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 缩写词中英文对照表 | 第13-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-28页 |
| 1.1 糖尿病研究现状 | 第14-18页 |
| 1.1.1 糖尿病发病情况 | 第14-15页 |
| 1.1.2 糖尿病的发病机理和治疗方法概述 | 第15-18页 |
| 1.1.2.1 I 型糖尿病 | 第15-16页 |
| 1.1.2.2 II 型糖尿病 | 第16-17页 |
| 1.1.2.3 妊娠期糖尿病（GDM） | 第17-18页 |
| 1.1.2.4 特异型糖尿病 | 第18页 |
| 1.2 胰岛素研究进展 | 第18-23页 |
| 1.2.1 胰岛素的结构和功能 | 第18-20页 |
| 1.2.2 胰岛素类药物的发展 | 第20-21页 |
| 1.2.3 基因工程技术表达重组人胰岛素的研究 | 第21-23页 |
| 1.3 油体表达系统概述 | 第23-26页 |
| 1.3.1 油体和油体蛋白 | 第23-25页 |
| 1.3.2 油体表达系统的特点和发展现状 | 第25-26页 |
| 1.4 本研究的目的和意义 | 第26-28页 |
| 第二章 材料与方法 | 第28-65页 |
| 2.1 实验材料 | 第28-32页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第28页 |
| 2.1.2 菌株和载体 | 第28页 |
| 2.1.3 细菌和植物培养基 | 第28-29页 |
| 2.1.4 生化试剂 | 第29-30页 |
| 2.1.5 主要仪器设备 | 第30页 |
| 2.1.6 试剂盒和部分溶液配方 | 第30-32页 |
| 2.2 实验方法 | 第32-65页 |
| 2.2.1 油体-小人胰岛素原融合基因（oleosin-mins）植物表达载体构建 | 第32-38页 |
| 2.2.1.1 小人胰岛素原基因（mins）合成 | 第32页 |
| 2.2.1.2 pUC57-mins 和op::og-Tα4-2300-twin 质粒提取 | 第32-33页 |
| 2.2.1.3 pUC57-mins 和op::og-Tα4-2300-twin 质粒酶切 | 第33-34页 |
| 2.2.1.4 酶切片段回收 | 第34-35页 |
| 2.2.1.5 回收片段连接 | 第35页 |
| 2.2.1.6 连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α | 第35-36页 |
| 2.2.1.7 阳性克隆的挑选和PCR 鉴定 | 第36-38页 |
| 2.2.2 油体-变异小人胰岛素原融合基因（oleosin-MF）植物表达载体构建 | 第38-44页 |
| 2.2.2.1 用PCR 方法进行基因序列突变 | 第38-39页 |
| 2.2.2.2 回收PCR 产物并克隆到pUC57 载体上 | 第39-42页 |
| 2.2.2.3 通过亚克隆得到完整的变异小人胰岛素原基因（MF） | 第42-44页 |
| 2.2.2.4 构建表达载体 | 第44页 |
| 2.2.3 双元表达载体转化根癌农杆菌GV3101 | 第44-46页 |
| 2.2.3.1 根癌农杆菌感受态的制备和转化 | 第44页 |
| 2.2.3.2 根癌农杆菌阳性克隆的鉴定 | 第44-46页 |
| 2.2.4 花浸染法转化拟南芥 | 第46-49页 |
| 2.2.4.1 拟南芥的栽培 | 第46页 |
| 2.2.4.2 转化拟南芥 | 第46页 |
| 2.2.4.3 拟南芥抗性株系筛选 | 第46-47页 |
| 2.2.4.4 DNA 小量提取和PCR 鉴定 | 第47-49页 |
| 2.2.5 转基因植株中外源基因变异小人胰岛素原（MF）Southern 杂交分析 | 第49-56页 |
| 2.2.5.1 转基因拟南芥基因组DNA 大量提取和纯化 | 第49-51页 |
| 2.2.5.2 基因组DNA 的限制性酶切和凝胶电泳分离 | 第51-52页 |
| 2.2.5.3 转膜印迹与固定 | 第52-53页 |
| 2.2.5.4 探针制备和标记 | 第53-55页 |
| 2.2.5.5 预杂交和杂交 | 第55页 |
| 2.2.5.6 封阻、抗体温育和洗膜 | 第55-56页 |
| 2.2.5.7 显影 | 第56页 |
| 2.2.6 转基因植株反转录PCR 分析 | 第56-60页 |
| 2.2.6.1 转基因拟南芥种子RNA 提取 | 第56-58页 |
| 2.2.6.2 转基因拟南芥叶片RNA 提取 | 第58-59页 |
| 2.2.6.3 两步法进行RNA 反转录PCR 检测 | 第59-60页 |
| 2.2.7 转基因拟南芥蛋白表达检测 | 第60-65页 |
| 2.2.7.1 拟南芥种子总蛋白提取 | 第60-61页 |
| 2.2.7.2 拟南芥种子总蛋白SDS-PAGE 检测 | 第61-63页 |
| 2.2.7.3 拟南芥种子总蛋白Western blot 检测 | 第63-65页 |
| 第三章 结果与分析 | 第65-79页 |
| 3.1 油体-小人胰岛素原融合基因（oleosin-mins）植物表达载体构建 | 第65-67页 |
| 3.1.1 小人胰岛素原基因（mins）的设计 | 第65-66页 |
| 3.1.2 双元表达载体op::og-mins-2300-twin 构建步骤 | 第66页 |
| 3.1.3 阳性克隆PCR 检测和测序 | 第66-67页 |
| 3.2 油体-变异小人胰岛素原融合基因（oleosin-MF）植物表达载体构建 | 第67-70页 |
| 3.2.1 人工引入突变获得变异小人胰岛素原基因（MF） | 第67-68页 |
| 3.2.2 双元表达载体op::og-MF-2300-twin 构建步骤 | 第68-69页 |
| 3.2.3 阳性克隆PCR 检测和测序 | 第69-70页 |
| 3.3 工程农杆菌GV3101 的制备 | 第70-71页 |
| 3.4 拟南芥的种植和农杆菌介导的遗传转化 | 第71-72页 |
| 3.5 转基因拟南芥的PCR 检测 | 第72-73页 |
| 3.6 转基因拟南芥Southern 杂交分析 | 第73-74页 |
| 3.7 目的基因在拟南芥中的表达分析 | 第74-76页 |
| 3.8 转基因拟南芥目标蛋白表达检测 | 第76-79页 |
| 3.8.1 种子总蛋白SDS-PAGE 分析 | 第76-77页 |
| 3.8.2 种子总蛋白Western 杂交分析 | 第77-79页 |
| 第四章 讨论 | 第79-83页 |
| 4.1 拟南芥作为油体植物生物反应器的模式植物 | 第79-80页 |
| 4.2 载体和基因的设计 | 第80页 |
| 4.3 目标蛋白分离纯化的路线 | 第80-81页 |
| 4.4 目标蛋白表达量的提高 | 第81页 |
| 4.5 荠菜油体启动子在拟南芥中的组织特异性 | 第81-82页 |
| 4.6 使用油体表达系统生产重组人胰岛素的经济价值 | 第82-83页 |
| 第五章 结论与展望 | 第83-85页 |
| 5.1 结论 | 第83-84页 |
| 5.2 后续研究工作 | 第84-85页 |
| 5.2.1 目的蛋白的分离纯化 | 第84页 |
| 5.2.2 植物油体表达的重组人胰岛素活性检测 | 第84页 |
| 5.2.3 融合蛋白在油菜中的表达 | 第84页 |
| 5.2.4 启动子组织特异性研究 | 第84-85页 |
| 参考文献 | 第85-89页 |
| 致谢 | 第89页 |
