| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 缩略词表 | 第14-15页 |
| 第一章 绪论 | 第15-36页 |
| 1.1 乳酸菌作为功能因子投递载体的研究概况 | 第15-22页 |
| 1.1.1 乳酸菌 | 第15页 |
| 1.1.2 乳酸菌的表达系统 | 第15-17页 |
| 1.1.3 乳酸菌的表达形式 | 第17-19页 |
| 1.1.4 乳酸菌作为粘膜投递载体的研究进展 | 第19-22页 |
| 1.2 乳酸菌黏附性能及黏附机制研究进展 | 第22-25页 |
| 1.2.1 乳酸菌黏附的作用 | 第22-23页 |
| 1.2.2 乳酸菌的黏附素 | 第23-25页 |
| 1.2.3 乳酸菌黏附素受体 | 第25页 |
| 1.3 Kisspeptin的研究进展 | 第25-31页 |
| 1.3.1 Kisspeptin的发现 | 第25-26页 |
| 1.3.2 KiSS1参与肿瘤侵袭、转移的潜在机制 | 第26-29页 |
| 1.3.3 KiSS1蛋白的生理功能 | 第29页 |
| 1.3.4 KiSS1与人类肿瘤 | 第29-31页 |
| 1.4 RGD肽在肿瘤治疗中的应用 | 第31-34页 |
| 1.4.1 RGD肽在肿瘤影像中的应用 | 第31-32页 |
| 1.4.2 RGD肽抑制肿瘤细胞的黏附迁移 | 第32页 |
| 1.4.3 RGD肽对肿瘤细胞凋亡的作用 | 第32-33页 |
| 1.4.4 RGD肽对肿瘤血管生成的影响 | 第33页 |
| 1.4.5 RGD肽在疾病治疗中的靶向作用 | 第33-34页 |
| 1.5 立体依据及研究意义 | 第34-35页 |
| 1.6 主要研究内容 | 第35-36页 |
| 第二章 比较基因组学鉴定植物乳杆菌NL42黏附蛋白 | 第36-49页 |
| 2.1 引言 | 第36页 |
| 2.2 材料与试剂 | 第36-37页 |
| 2.2.1 实验菌株及培养方法 | 第36页 |
| 2.2.2 主要试剂及溶液配制 | 第36-37页 |
| 2.2.3 主要仪器设备 | 第37页 |
| 2.3 实验方法 | 第37-38页 |
| 2.3.1 乳杆菌基因组的提取 | 第37-38页 |
| 2.3.2 琼脂糖凝胶电泳 | 第38页 |
| 2.3.3 基因组测序及比较基因组学分析方法 | 第38页 |
| 2.3.4 其他生物信息学软件 | 第38页 |
| 2.4 结果与分析 | 第38-47页 |
| 2.4.1 植物乳杆菌NL42全基因组测序及分析 | 第38-39页 |
| 2.4.2 植物乳杆菌NL42的亲缘关系分析 | 第39-41页 |
| 2.4.3 植物乳杆菌NL42与其他植物乳杆菌编码区比较分析 | 第41-42页 |
| 2.4.4 植物乳杆菌基因的COG分类 | 第42页 |
| 2.4.5 植物乳杆菌黏附蛋白分析 | 第42-43页 |
| 2.4.6 比较基因组学分析CwaA蛋白结构 | 第43-44页 |
| 2.4.7 CwaA氨基酸序列及蛋白结构分析 | 第44-47页 |
| 2.5 讨论 | 第47-48页 |
| 2.6 小结 | 第48-49页 |
| 第三章 CwaA提高了乳酸乳球菌NZ9000对肠上皮细胞的黏附能力 | 第49-64页 |
| 3.1 引言 | 第49页 |
| 3.2 材料与试剂 | 第49-52页 |
| 3.2.1 实验菌株与质粒 | 第49-50页 |
| 3.2.2 菌株培养方法 | 第50页 |
| 3.2.3 主要试剂及溶液配制 | 第50-51页 |
| 3.2.4 主要仪器设备 | 第51-52页 |
| 3.3 实验方法 | 第52-56页 |
| 3.3.1 乳酸乳球菌NZ9000感受态制备及转化 | 第52页 |
| 3.3.2 cwaA基因的克隆及诱导表达 | 第52页 |
| 3.3.3 蛋白免疫印迹(westernblot) | 第52-54页 |
| 3.3.4 自聚集实验 | 第54页 |
| 3.3.5 疏水性实验 | 第54页 |
| 3.3.6 HT-29细胞的培养 | 第54页 |
| 3.3.7 黏附实验 | 第54-55页 |
| 3.3.8 高碘酸钠和胰酶处理细胞 | 第55页 |
| 3.3.9 糖抑制实验 | 第55页 |
| 3.3.10 乳酸菌竞争性抑制病原菌黏附实验 | 第55页 |
| 3.3.11 实验数据分析 | 第55-56页 |
| 3.4 结果与分析 | 第56-62页 |
| 3.4.1 cwaA基因的PCR扩增 | 第56页 |
| 3.4.2 cwaA基因的表达载体构建及转化 | 第56-57页 |
| 3.4.3 Western blot检测CwaA在乳酸乳球菌NZ9000中的表达 | 第57-58页 |
| 3.4.4 重组菌株自聚集能力变化 | 第58页 |
| 3.4.5 重组菌株疏水性变化 | 第58-59页 |
| 3.4.6 重组菌株对肠上皮细胞HT-29的黏附性 | 第59-60页 |
| 3.4.7 重组菌株对病原菌抵抗能力的提高 | 第60-61页 |
| 3.4.8 CwaA黏附受体的评价 | 第61-62页 |
| 3.5 讨论 | 第62-63页 |
| 3.6 小结 | 第63-64页 |
| 第四章 乳酸菌分泌表达肿瘤转移抑制蛋白KiSS1 | 第64-80页 |
| 4.1 引言 | 第64页 |
| 4.2 材料与试剂 | 第64-67页 |
| 4.2.1 试验菌株及培养方法 | 第64-65页 |
| 4.2.2 主要试剂及溶液配制 | 第65-66页 |
| 4.2.3 仪器与设备 | 第66页 |
| 4.2.4 实验引物 | 第66-67页 |
| 4.3 实验方法 | 第67-70页 |
| 4.3.1 kiss1基因的克隆及诱导表达 | 第67页 |
| 4.3.2 乳酸乳球菌NZ9000感受态制备及转化 | 第67页 |
| 4.3.3 乳酸菌分泌蛋白Elisa测定 | 第67-68页 |
| 4.3.4 Western blot检测 | 第68页 |
| 4.3.5 提取细菌分泌蛋白 | 第68页 |
| 4.3.6 MTT试验 | 第68页 |
| 4.3.7 Annexin v /PI法测细胞凋亡 | 第68-69页 |
| 4.3.8 划痕试验 | 第69页 |
| 4.3.9 细胞蛋白的提取 | 第69页 |
| 4.3.10 细胞RNA的提取 | 第69-70页 |
| 4.3.11 实验数据分析 | 第70页 |
| 4.4 结果与分析 | 第70-78页 |
| 4.4.1 KiSS1表达载体的构建 | 第70-71页 |
| 4.4.2 Western blot检测胞内外蛋白分泌 | 第71-72页 |
| 4.4.3 表达条件的优化和KiSS1分泌量的测定 | 第72-73页 |
| 4.4.4 KiSS1蛋白抑制了HT-29细胞的增殖 | 第73-74页 |
| 4.4.5 KiSS1蛋白对HT-29细胞的迁移抑制作用 | 第74-75页 |
| 4.4.6 KiSS1改变了HT-29细胞形态,诱导了HT-29细胞的凋亡 | 第75-76页 |
| 4.4.7 KiSS1对HT-29细胞作用通路的研究 | 第76-78页 |
| 4.5 讨论 | 第78-79页 |
| 4.6 小结 | 第79-80页 |
| 第五章 RGD修饰肽增加了KiSS1对HT-29细胞的靶向性及抑制作用 | 第80-92页 |
| 5.1 引言 | 第80页 |
| 5.2 材料与试剂 | 第80-82页 |
| 5.2.1 试验菌株及培养方法 | 第80-81页 |
| 5.2.2 主要试剂及溶液配制 | 第81页 |
| 5.2.3 仪器与设备 | 第81-82页 |
| 5.3 实验方法 | 第82-84页 |
| 5.3.1 共聚焦显微镜观察HT-29细胞吸收带有和不带有RGD的KiSS1蛋白 | 第82页 |
| 5.3.2 KiSS1RGD的克隆及诱导表达 | 第82-83页 |
| 5.3.3 Elisa测定菌株分泌KiSS1蛋白的量 | 第83页 |
| 5.3.4 共聚焦检测分泌的KiSS1RGD活性 | 第83页 |
| 5.3.5 MTT试验 | 第83页 |
| 5.3.6 凋亡试验 | 第83页 |
| 5.3.7 划痕试验 | 第83页 |
| 5.3.8 分泌肽对Caco2细胞单层的转运吸收 | 第83-84页 |
| 5.3.9 实验数据分析 | 第84页 |
| 5.4 实验结果 | 第84-90页 |
| 5.4.1 RGD肽增加了HT-29细胞对KiSS1的吸收作用 | 第84-85页 |
| 5.4.2 乳酸乳球菌表达RGD修饰的KiSS1蛋白 | 第85-86页 |
| 5.4.3 分泌肽与FITC标记的荧光肽竞争结合HT-29细胞 | 第86-87页 |
| 5.4.4 带有RGD的肽对HT-29细胞增殖的影响 | 第87页 |
| 5.4.5 带有RGD的肽对HT-29细胞凋亡的影响 | 第87-89页 |
| 5.4.6 带有RGD的肽对HT-29细胞迁移的影响 | 第89-90页 |
| 5.4.7 乳酸菌分泌蛋白KiSS1和KiSS1RGD对小肠上皮细胞Caco2的穿膜作用 | 第90页 |
| 5.5 讨论 | 第90-91页 |
| 5.6 小结 | 第91-92页 |
| 第六章 黏附力提高的乳酸乳球菌表达RGD修饰的KiSS1蛋白 | 第92-101页 |
| 6.1 引言 | 第92页 |
| 6.2 材料与试剂 | 第92-93页 |
| 6.2.1 实验菌株及培养方法 | 第92-93页 |
| 6.2.2 主要试剂及溶液配制 | 第93页 |
| 6.2.3 主要仪器设备 | 第93页 |
| 6.3 实验方法 | 第93-95页 |
| 6.3.1 共表达载体的构建 | 第93-94页 |
| 6.3.2 乳酸乳球菌NZ9000感受态制备及转化 | 第94页 |
| 6.3.3 乳酸菌全细胞蛋白、细胞壁蛋白及分泌蛋白的提取 | 第94页 |
| 6.3.4 Western blot检测 | 第94页 |
| 6.3.5 KiSS1的Elisa测定 | 第94页 |
| 6.3.6 caspase3和caspase9酶活的测定 | 第94-95页 |
| 6.3.7 实验数据分析 | 第95页 |
| 6.4 结果与分析 | 第95-99页 |
| 6.4.1 构建共表达载体 | 第95-97页 |
| 6.4.2 Western blot检测蛋白表达 | 第97页 |
| 6.4.3 黏附菌与非黏附菌投递的KiSS1RGD的量 | 第97-98页 |
| 6.4.4 黏附与非黏附菌株对caspase3,caspase9酶活的影响 | 第98-99页 |
| 6.5 讨论 | 第99页 |
| 6.6 小结 | 第99-101页 |
| 第七章 全文结论与展望 | 第101-103页 |
| 7.1 结论 | 第101-102页 |
| 7.2 论文创新点 | 第102页 |
| 7.3 展望 | 第102-103页 |
| 参考文献 | 第103-118页 |
| 附录 | 第118-123页 |
| 致谢 | 第123-125页 |
| 个人简介 | 第125页 |
