| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 文献综述 | 第10-22页 |
| 1.1 基因编辑技术 | 第10-18页 |
| 1.1.1 基于ES打靶的同源重组技术 | 第10-11页 |
| 1.1.2 核酸酶介导的基因编辑技术 | 第11-18页 |
| 1.1.2.1 ZFN技术 | 第12-13页 |
| 1.1.2.2 TALEN技术 | 第13-15页 |
| 1.1.2.3 CRISPR/Cas9技术 | 第15-18页 |
| 1.2 FVⅢ与甲型血友病 | 第18-21页 |
| 1.2.1 FVⅢ结构与功能 | 第18-20页 |
| 1.2.2 甲型血友病 | 第20-21页 |
| 1.2.2.1 甲型血友病的临床表现 | 第20页 |
| 1.2.2.2 甲型血友病的发病机制 | 第20-21页 |
| 1.3 甲型血友病小鼠模型的研究意义 | 第21-22页 |
| 第二章 TALEN技术介导的FVⅢ基因敲除小鼠的制备 | 第22-36页 |
| 2.1 实验材料 | 第22-24页 |
| 2.1.1 实验材料和试剂 | 第22-23页 |
| 2.1.2 实验仪器 | 第23-24页 |
| 2.2 实验方法 | 第24-32页 |
| 2.2.1 载体构建 | 第24-25页 |
| 2.2.1.1 设计TALEN识别序列 | 第24页 |
| 2.2.1.2 载体构建 | 第24-25页 |
| 2.2.2 TALEN对培养细胞的基因编辑 | 第25-29页 |
| 2.2.2.1 细胞转染 | 第25-27页 |
| 2.2.2.2 转染细胞提取基因组 | 第27-28页 |
| 2.2.2.3 提取细胞基因组进行PCR扩增 | 第28-29页 |
| 2.2.2.4 T7EI检测细胞基因组PCR产物 | 第29页 |
| 2.2.3 TALEN对动物个体的基因编辑 | 第29-32页 |
| 2.2.3.1 TALEN表达质粒体外转录mRNA | 第29-30页 |
| 2.2.3.2 显微注射mRNA和胚胎移植 | 第30-31页 |
| 2.2.3.3 F0代小鼠的突变检测 | 第31-32页 |
| 2.3 实验结果 | 第32-36页 |
| 2.3.1 TALEN载体构建 | 第32-33页 |
| 2.3.2 TALEN对培养细胞的基因编辑 | 第33-34页 |
| 2.3.3 TALEN对动物个体的基因编辑 | 第34-36页 |
| 2.3.3.1 TALEN质粒体外转录mRNA | 第34页 |
| 2.3.3.2 mRNA注射和胚胎移植 | 第34页 |
| 2.3.3.3 F0代小鼠的突变检测 | 第34-36页 |
| 第三章 CRISPR/Cas9技术介导的FVⅢ基因敲除小鼠的制备 | 第36-46页 |
| 3.1 实验材料和试剂 | 第36页 |
| 3.2 实验方法 | 第36-40页 |
| 3.2.1 CRISPR/Cas9载体构建 | 第36-38页 |
| 3.2.1.1 CRISPR/Cas9 gRNA设计 | 第36-37页 |
| 3.2.1.2 CRISPR/Cas9载体构建 | 第37-38页 |
| 3.2.2 CRISPR/Cas9对培养细胞的基因编辑 | 第38-39页 |
| 3.2.2.1 细胞转染 | 第38页 |
| 3.2.2.2 突变检测 | 第38-39页 |
| 3.2.2.3 脱靶检测 | 第39页 |
| 3.2.3 CRISPR/Cas9对动物个体的基因编辑 | 第39-40页 |
| 3.2.3.1 体外转录gRNA和Cas9 mRNA | 第39-40页 |
| 3.2.3.2 显微注射mRNA和胚胎移植 | 第40页 |
| 3.2.3.3 阳性小鼠检测和T-A克隆测序 | 第40页 |
| 3.3 实验结果与分析 | 第40-46页 |
| 3.3.1 载体构建 | 第40-41页 |
| 3.3.2 CRISPR/Cas9对细胞基因组的编辑 | 第41-42页 |
| 3.3.3 CRISPR/Cas9对小鼠基因组的编辑 | 第42-46页 |
| 3.3.3.1 体外转录gRNA和Cas9 mRNA | 第42页 |
| 3.3.3.2 显微注射mRNA和胚胎移植 | 第42-43页 |
| 3.3.3.3 F0代小鼠的突变检测 | 第43-46页 |
| 第四章 FVⅢ基因敲除小鼠后裔的突变检测与繁育 | 第46-49页 |
| 4.1 实验材料和试剂 | 第46页 |
| 4.2 实验方法 | 第46页 |
| 4.2.1 FVⅢ基因敲除小鼠后裔的突变检测 | 第46页 |
| 4.2.2 FVⅢ基因敲除小鼠后裔的繁育 | 第46页 |
| 4.3 实验结果与分析 | 第46-49页 |
| 4.3.1 敲除小鼠后裔的突变检测 | 第46-48页 |
| 4.3.2 FVⅢ基因敲除小鼠后裔的繁育 | 第48-49页 |
| 第五章 FVⅢ基因敲除小鼠的表型分析 | 第49-53页 |
| 5.1 实验材料和试剂 | 第49页 |
| 5.2 实验方法 | 第49-51页 |
| 5.2.1 凝血反应检测 | 第49-50页 |
| 5.2.1.1 活化部分凝血酶原时间(APTT)测定 | 第49页 |
| 5.2.1.2 凝血酶原时间(PT)测定 | 第49-50页 |
| 5.2.2 蛋白质免疫印迹检测FVⅢ | 第50-51页 |
| 5.3 实验结果 | 第51-53页 |
| 5.3.1 FVⅢ基因敲除小鼠凝血途径的检测 | 第51-52页 |
| 5.3.2 FVⅢ基因敲除小鼠的蛋白表达分析 | 第52-53页 |
| 第六章 讨论与结论 | 第53-57页 |
| 6.1 TALEN和CRISPR/Cas9技术比较 | 第53-54页 |
| 6.2 胚胎胞质注射TALEN mRNA产生Mosaic小鼠的讨论 | 第54-55页 |
| 6.3 FVⅢ基因敲除小鼠表型分析探讨 | 第55-56页 |
| 6.4 结论 | 第56-57页 |
| 第七章 展望 | 第57-58页 |
| 附录 | 第58-67页 |
| 参考文献 | 第67-76页 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 | 第76-77页 |
| 致谢 | 第77页 |
