| 摘要 | 第3-6页 |
| Abstract | 第6-9页 |
| 中英文缩略词表 | 第16-17页 |
| 前言 | 第17-20页 |
| 第1章 Rock2基因在结直肠癌组织中的表达及其临床意义 | 第20-34页 |
| 引言 | 第20页 |
| 材料和方法 | 第20-29页 |
| 1. 材料 | 第20-24页 |
| 1.1 临床标本收集 | 第20-22页 |
| 1.2 试剂 | 第22页 |
| 1.3 自配试剂 | 第22-24页 |
| 1.4 主要仪器设备 | 第24页 |
| 2. 结直肠癌组织和癌旁组织RNA的提取及实时荧光定量 | 第24-26页 |
| 2.1 总RNA提取 | 第24-25页 |
| 2.2 RNA逆转录成cDNA | 第25页 |
| 2.3 实时荧光定量PCR扩增 | 第25-26页 |
| 3. 免疫组化染色 | 第26-27页 |
| 3.1 步骤 | 第26页 |
| 3.2 免疫组化结果分析 | 第26-27页 |
| 4. 蛋白免疫印迹反应（Western blot） | 第27-29页 |
| 4.1 结直肠癌旁组织和癌组织蛋白的提取 | 第27页 |
| 4.2 蛋白浓度测定（BCA法） | 第27页 |
| 4.3 SDS－PAGE电泳 | 第27-28页 |
| 4.4 转膜 | 第28页 |
| 4.5 免疫反应 | 第28页 |
| 4.6 化学发光，显影，定影 | 第28页 |
| 4.7 凝胶图象分析 | 第28-29页 |
| 4.8 一抗二抗去除液 | 第29页 |
| 5. 数据分析及统计方法 | 第29页 |
| 结果 | 第29-32页 |
| 1. Rock2基因在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达 | 第29-30页 |
| 2. Rock2在结直肠癌组织中表达的临床意义 | 第30-32页 |
| 讨论 | 第32-33页 |
| 结论 | 第33-34页 |
| 第2章 Rock2基因对结肠癌细胞侵袭和转移能力的影响 | 第34-69页 |
| 引言 | 第34页 |
| 第一节 体外实验观察改变结肠癌细胞中Rock2的表达对肿瘤细胞侵袭和迁移的影响 | 第34-60页 |
| 材料与方法 | 第34-53页 |
| 1. 材料 | 第34-38页 |
| 1.1 实验材料 | 第34-35页 |
| 1.2 自配试剂 | 第35-37页 |
| 1.3 主要仪器设备 | 第37-38页 |
| 2. 细胞培养 | 第38-39页 |
| 2.1 细胞复苏 | 第38页 |
| 2.2 细胞传代 | 第38页 |
| 2.3 细胞冻存 | 第38-39页 |
| 2.4 Lipofectamine 3000 法转染结肠癌细胞 | 第39页 |
| 3. Rock2干扰质粒构建 | 第39-46页 |
| 3.1 shRock2干扰质粒的对应靶序列 | 第39页 |
| 3.2 构建质粒 | 第39-45页 |
| 3.3 无内毒素质粒大量提取 | 第45-46页 |
| 4. pcDNA3.1（+）-Rock2重组质粒的构建 | 第46-50页 |
| 4.1 pcDNA3.1（+）-Rock2构建的引物 | 第47页 |
| 4.2 细胞总RNA提取 | 第47-48页 |
| 4.3 RNA逆转录成cDNA | 第48页 |
| 4.4 PCR扩增 | 第48-49页 |
| 4.5 PCR产物胶回收 | 第49-50页 |
| 4.6 双酶切及连接反应 | 第50页 |
| 4.7 制备感受态细胞 | 第50页 |
| 4.8 质粒小量抽提 | 第50页 |
| 4.9 质粒酶切鉴定 | 第50页 |
| 4.10 无内毒素质粒大量提取 | 第50页 |
| 5. RNA的提取及实时荧光定量PCR | 第50-51页 |
| 6. 蛋白免疫印迹反应（Western blot） | 第51-52页 |
| 6.1 细胞总蛋白的提取 | 第51页 |
| 6.2 BCA法蛋白浓度测定 | 第51页 |
| 6.3 SDS－PAGE电泳 | 第51页 |
| 6.4 转膜 | 第51页 |
| 6.5 免疫反应 | 第51页 |
| 6.6 化学发光，显影，定影 | 第51页 |
| 6.7 凝胶图象分析 | 第51页 |
| 6.8 一抗二抗去除液 | 第51-52页 |
| 7. Transwell侵袭实验 | 第52页 |
| 8. Transwell迁移实验 | 第52页 |
| 9. 划痕实验 | 第52-53页 |
| 10. 统计分析 | 第53页 |
| 结果 | 第53-60页 |
| 1. 结肠癌细胞株中Rock2基因的表达情况 | 第53页 |
| 2. shRock2干扰质粒降低Rock2基因表达的效果筛选 | 第53-54页 |
| 3. 验证结肠癌细胞中转染pcDNA3.1-（+）-Rock2质粒后Rock2的表达 | 第54页 |
| 4. 观察下调Rock2的蛋白表达对SW480和LOVO迁移及侵袭的影响 | 第54-58页 |
| 4.1 利用Western blot检测加入Rock2抑制剂Y27632和转染shRock2干扰质粒的SW480和LOVO细胞中Rock2的蛋白表达。 | 第54-55页 |
| 4.2 利用Transwell迁移实验分析下调Rock2的表达对SW480和LOVO细胞迁移的影响 | 第55-56页 |
| 4.3 利用Transwell侵袭实验分析下调Rock2的表达对SW480和LOVO细胞迁移的影响 | 第56-57页 |
| 4.4 利用划痕实验分析下调Rock2的表达对SW480和LOVO细胞迁移的影响 | 第57-58页 |
| 5. 观察上调结肠癌细胞HCT-116 中Rock2的表达对肿瘤细胞迁移及侵袭的影响 | 第58-60页 |
| 5.1 Transwell实验分析上调结肠癌细胞HCT-116 中Rock2的表达对肿瘤细胞迁移及侵袭的影响 | 第58-59页 |
| 5.2 划痕实验检测上调结肠癌细胞HCT-116 中Rock2表达对肿瘤细胞迁移能力的影响 | 第59-60页 |
| 第二节 体内实验观察下调Rock2表达对结肠癌转移能力的影响 | 第60-67页 |
| 材料和方法 | 第60-65页 |
| 1. 材料 | 第60-62页 |
| 1.1 实验材料 | 第60页 |
| 1.2 试剂 | 第60页 |
| 1.3 自配试剂 | 第60-62页 |
| 1.4 主要的仪器设备 | 第62页 |
| 2. 建立稳定转染shRock2质粒的结肠癌细胞株 | 第62-63页 |
| 2.1 筛选浓度梯度实验 | 第62页 |
| 2.2 筛选稳转shRock2质粒的结肠癌细胞株 | 第62-63页 |
| 2.3 shRock2的干扰效果检测 | 第63页 |
| 3. 动物实验 | 第63-64页 |
| 3.1 研究设计原则 | 第63页 |
| 3.2 细胞的准备 | 第63页 |
| 3.3 动物模型的构建 | 第63-64页 |
| 4. HE染色 | 第64-65页 |
| 5. 统计学处理 | 第65页 |
| 结果 | 第65-67页 |
| 1. G418浓度的确定 | 第65-66页 |
| 2. 观察稳定转染shRock2-c质粒和shNC质粒的SW480细胞中Rock2 mRNA和蛋白的表达变化 | 第66页 |
| 3. 实验裸鼠存活情况 | 第66页 |
| 4. 实验裸鼠肝转移情况 | 第66-67页 |
| 讨论 | 第67-68页 |
| 结论 | 第68-69页 |
| 第3章 Rock2通过β-catenin/TCF4信号通路促进结肠癌细胞的侵袭和迁移 | 第69-82页 |
| 引言 | 第69页 |
| 材料和方法 | 第69-74页 |
| 1 材料 | 第69-70页 |
| 1.1 实验材料 | 第69页 |
| 1.2 试剂 | 第69-70页 |
| 1.3 主要仪器设备 | 第70页 |
| 2 细胞培养及转染 | 第70页 |
| 3. HA-β-catenin及shβ-catenin质粒的构建 | 第70-71页 |
| 3.1 shβ-catenin的靶序列及HA-β-catenin的PCR引物 | 第70-71页 |
| 3.2 构建干扰及过表达β-catenin质粒 | 第71页 |
| 4. 报告基因实验 | 第71-73页 |
| 5. 蛋白免疫印迹反应 | 第73-74页 |
| 5.1 核浆蛋白分离 | 第73页 |
| 5.2 其他步骤 | 第73-74页 |
| 6. 统计学分析 | 第74页 |
| 结果 | 第74-79页 |
| 1. shβ-catenin质粒降低β-catenin基因表达的效果筛选 | 第74页 |
| 2. 验证结肠癌细胞中转染HA-β-catenin质粒后β-catenin的表达 | 第74-75页 |
| 3. Rock2调节结肠癌细胞的侵袭和转移依赖于β-catenin/TCF4通路 | 第75-79页 |
| 3.1 观察在结肠癌细胞中改变Rock2的表达对β-catenin/TCF4通路的影响 | 第75-77页 |
| 3.2 在结肠癌细胞中下调Rock2表达的同时激活β-catenin/TCF4通路，分析肿瘤细胞侵袭及迁移能力的变化。 | 第77-78页 |
| 3.3 在结肠癌细胞中上调Rock2表达的同时抑制β-catenin/TCF4通路，分析肿瘤细胞迁移及侵袭能力的变化。 | 第78-79页 |
| 讨论 | 第79-81页 |
| 结论 | 第81-82页 |
| 第4章 Rock2调控β-catenin/TCF4信号通路的机制研究 | 第82-91页 |
| 引言 | 第82页 |
| 材料和方法 | 第82-85页 |
| 1. 材料 | 第82-83页 |
| 1.1 实验材料 | 第82页 |
| 1.2 试剂 | 第82-83页 |
| 1.3 主要仪器设备 | 第83页 |
| 2. 细胞培养及转染 | 第83页 |
| 3. 质粒构建 | 第83页 |
| 4. 蛋白免疫印迹反应 | 第83页 |
| 5. 免疫共沉淀 | 第83-84页 |
| 6. 激光共聚焦免疫荧光实验 | 第84页 |
| 7. 统计学分析 | 第84-85页 |
| 结果 | 第85-89页 |
| 1. β-catenin蛋白在结肠癌细胞中通过泛素-蛋白酶体系统降解 | 第85-86页 |
| 2.Rock2通过抑制β-catenin的泛素化降解稳定β-catenin的蛋白表达 | 第86-89页 |
| 讨论 | 第89-90页 |
| 结论 | 第90-91页 |
| 全文总结 | 第91-93页 |
| 致谢 | 第93-94页 |
| 参考文献 | 第94-97页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第97-98页 |
| 综述 | 第98-102页 |
| 参考文献 | 第100-102页 |
