| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 1 引言 | 第14-26页 |
| 1.1 背景介绍 | 第14页 |
| 1.2 EGFR的结构与功能 | 第14-15页 |
| 1.3 EGF刺激后EGFR的内吞和降解 | 第15-16页 |
| 1.4 EGFR-TKI及其作用机理 | 第16-17页 |
| 1.5 EGFR-TKI的耐药机制 | 第17-23页 |
| 1.5.1 原发性耐药机制 | 第18页 |
| 1.5.2 获得性耐药机制 | 第18-23页 |
| 1.6 盐酸埃克替尼(icotinib) | 第23页 |
| 1.7 基因组变异与EGFR-TKI耐药 | 第23-24页 |
| 1.8 全外显子测序技术及其应用 | 第24-25页 |
| 1.9 本研究的目的和意义 | 第25-26页 |
| 2 实验材料 | 第26-32页 |
| 2.1 细胞系 | 第26页 |
| 2.2 药品和抑制剂 | 第26页 |
| 2.3 主要试剂 | 第26-28页 |
| 2.4 主要仪器设备 | 第28-29页 |
| 2.5 主要缓冲液配制 | 第29-32页 |
| 3 实验方法 | 第32-50页 |
| 3.1 细胞培养 | 第32页 |
| 3.2 EGFR突变状态的检测 | 第32-35页 |
| 3.2.1 细胞基因组DNA的提取 | 第32-33页 |
| 3.2.2 DNA定量 | 第33页 |
| 3.2.3 PCR扩增 | 第33-34页 |
| 3.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测DNA | 第34-35页 |
| 3.2.5 测序 | 第35页 |
| 3.3 耐药细胞株的建立与鉴定 | 第35-40页 |
| 3.3.1 耐药细胞株的建立 | 第35页 |
| 3.3.2 耐药细胞形态学的观察 | 第35页 |
| 3.3.3 耐药细胞活性的检测 | 第35-36页 |
| 3.3.4 耐药细胞的迁移能力检测 | 第36页 |
| 3.3.5 耐药细胞中药物靶蛋白及其磷酸化蛋白表达水平的检测( Western Blot法) | 第36-40页 |
| 3.3.6 耐药细胞上皮间质转换能力的检测(免疫荧光法) | 第40页 |
| 3.4 亲本与耐药细胞全外显子测序及分析 | 第40-42页 |
| 3.4.1 细胞DNA样品的收集及质量检测 | 第40-41页 |
| 3.4.2 全外显子测序 | 第41-42页 |
| 3.5 PC-9/IR耐药细胞基因组中SNP与耐药的研究 | 第42-45页 |
| 3.5.1 EGFR20外显子T790M突变 | 第42页 |
| 3.5.2 耐药细胞中T790M突变的逆转 | 第42页 |
| 3.5.3 MAPK基因和RAS/Raf通过活性的检测及其治疗策略 | 第42-45页 |
| 3.6 PC-9/IR耐药细胞基因组中拷贝数(CNV)与耐药研究 | 第45-48页 |
| 3.6.1 标准曲线的绘制 | 第45-47页 |
| 3.6.2 PC-9和PC-9/IR细胞中钙蛋白酶7 DNA拷贝数的检测 | 第47页 |
| 3.6.3 PC-9和PC-9/IR细胞中钙蛋白酶7在mRNA和蛋白水平表达的检测 | 第47-48页 |
| 3.7 A549和H1975细胞icotinib诱导后细胞中后CAPN7的验证 | 第48页 |
| 3.7.1 A549和H1975细胞大剂量icotinib的诱导和鉴定 | 第48页 |
| 3.7.2 A549和H1975细胞及icotinib诱导后细胞中钙蛋白酶7在DNA拷贝数及mRNA和蛋白表达水平的检测 | 第48页 |
| 3.8 相关数据统计学分析 | 第48-50页 |
| 4 研究结果 | 第50-76页 |
| 4.1 非小细胞肺癌细胞株PC-9 EGFR突变状态的检测 | 第50页 |
| 4.2 盐酸埃克替尼耐药的人非小细胞肺癌细胞株PC-9/IR的建立 | 第50-51页 |
| 4.3 Icotinib耐药细胞株PC-9/IR的鉴定 | 第51-55页 |
| 4.3.1 亲本与耐药细胞形态学的观察 | 第51页 |
| 4.3.2 亲本和耐药细胞活力的测定(MTT) | 第51-52页 |
| 4.3.3 耐药细胞迁移能力的检测 | 第52-53页 |
| 4.3.4 亲本和耐药细胞中icotinib靶点EGFR蛋白的检测 | 第53-54页 |
| 4.3.5 耐药细胞中钙黏蛋白和波形蛋白表达的检测 | 第54-55页 |
| 4.4 PC-9亲本和耐药细胞基因组外显子测序 | 第55-65页 |
| 4.4.1 细胞DNA样品的提取和质检 | 第55-56页 |
| 4.4.2 外显子测序的流程 | 第56-57页 |
| 4.4.3 全外显子测序的相关数据 | 第57-58页 |
| 4.4.4 亲本和耐药细胞中基因变异的比较 | 第58-65页 |
| 4.5 PC-9/IR细胞基因组中变异SNV与耐药性的研究 | 第65-68页 |
| 4.5.1 EGFR20外显子T790M突变 | 第65-66页 |
| 4.5.2 耐药细胞中T790M突变的逆转 | 第66-67页 |
| 4.5.3 MAPK基因和RAS/Raf通过活性的检测及其治疗策略 | 第67-68页 |
| 4.6 PC-9/IR细胞基因组中变异CNV与耐药的研究 | 第68-71页 |
| 4.6.1 标准曲线的绘制 | 第69-70页 |
| 4.6.2 PC-9和PC-9/IR细胞中钙蛋白酶7 DNA拷贝数的检测 | 第70页 |
| 4.6.3 PC-9和PC-9/IR细胞中钙蛋白酶7在mRNA和蛋白水平表达的检测 | 第70-71页 |
| 4.7 A549和H1975细胞icotinib诱导后细胞中钙蛋白酶7的检测 | 第71-76页 |
| 4.7.1 A549和H1975细胞大剂量icotinib的诱导和鉴定 | 第72-73页 |
| 4.7.2 A549和H1975亲本及icotinib诱导后细胞中钙蛋白酶7在DNA拷贝数及mRNA和蛋白表达水平的检测 | 第73-76页 |
| 5 讨论 | 第76-80页 |
| 6 结论 | 第80-82页 |
| 参考文献 | 第82-88页 |
| 作者简历及攻读硕士学位期间取得的研究成果 | 第88-92页 |
| 学位论文数据集 | 第92页 |
