| 英文缩略词及中文对照表 | 第1-10页 |
| 中文摘要 | 第10-12页 |
| ABSTRACT | 第12-14页 |
| 1 引言 | 第14-40页 |
| ·脂肪酶的研究进展 | 第14-28页 |
| ·微生物脂肪酶的分类 | 第14-18页 |
| ·脂肪酶的结构 | 第18-21页 |
| ·脂肪酶的一级结构 | 第18-19页 |
| ·脂肪酶的二级结构 | 第19-20页 |
| ·脂肪酶的三级结构 | 第20-21页 |
| ·微生物脂肪酶的理化性质 | 第21-22页 |
| ·脂肪酶的催化机理和催化特性 | 第22-24页 |
| ·脂肪酸特异性 | 第22-23页 |
| ·位置选择性 | 第23页 |
| ·立体特异性 | 第23-24页 |
| ·脂肪酶产生菌 | 第24-25页 |
| ·脂肪酶的活力测定 | 第25-26页 |
| ·微生物脂肪酶在工业中的应用 | 第26-28页 |
| ·食品工业方面的应用 | 第26-27页 |
| ·纺织和化工工业方面的应用 | 第27页 |
| ·医药工业方面的应用 | 第27-28页 |
| ·生物柴油合成方面的应用 | 第28页 |
| ·微生物酶的分子改造 | 第28-39页 |
| ·微生物酶分子改造的方法 | 第29-35页 |
| ·定点突变 | 第29-30页 |
| ·定向进化 | 第30-34页 |
| ·融合表达 | 第34-35页 |
| ·截断表达 | 第35页 |
| ·定向进化文库的筛选策略 | 第35-38页 |
| ·分光光度测量法和荧光检测法 | 第35-36页 |
| ·酸检测法 | 第36页 |
| ·肾上腺素检测法 | 第36-37页 |
| ·酵母表面展示技术 | 第37页 |
| ·表面增强拉曼散射共振法 | 第37-38页 |
| ·脂肪酶的定向进化 | 第38-39页 |
| ·选题的目的意义、研究内容、技术路线 | 第39-40页 |
| ·选题的目的意义 | 第39页 |
| ·研究内容 | 第39-40页 |
| 2 材料与方法 | 第40-60页 |
| ·材料 | 第40-43页 |
| ·菌株与质粒 | 第40页 |
| ·酶和生物制剂 | 第40页 |
| ·仪器 | 第40页 |
| ·溶液及培养基配制 | 第40-43页 |
| ·溶液配制 | 第40-43页 |
| ·培养基配制 | 第43页 |
| ·疏绵状嗜热丝胞菌脂肪酶 LGY 在毕赤酵母中的表达 | 第43-55页 |
| ·LGY 成熟肽基因序列的分离 | 第43-46页 |
| ·LGY 成熟肽基因序列的限制性酶切位点分析 | 第43页 |
| ·引物设计以及 LGY 成熟肽基因序列的分离 | 第43-44页 |
| ·PCR 产物回收 | 第44-45页 |
| ·载体连接 | 第45页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第45-46页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第45-46页 |
| ·大肠杆菌感受态的转化 | 第46页 |
| ·菌落 PCR 检测 | 第46页 |
| ·序列测定 | 第46页 |
| ·质粒提取 | 第46-48页 |
| ·脂肪酶 LGY 在毕赤酵母中的表达 | 第48-54页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第48页 |
| ·线性化质粒 DNA 的制备 | 第48-49页 |
| ·线性片段纯化 | 第49页 |
| ·酵母转化 | 第49-50页 |
| ·毕赤酵母 GS115 感受态细胞的制备（电击法） | 第49-50页 |
| ·重组表达质粒 pPIC9K/lgy 电击转化酵母感受态细胞 | 第50页 |
| ·酵母转化子的筛选与鉴定 | 第50-52页 |
| ·酵母转化子甲醇利用表型的平板筛选 | 第50-51页 |
| ·酵母转化子的 PCR 鉴定 | 第51-52页 |
| ·外源基因多拷贝整合转化子筛选 | 第52-53页 |
| ·酵母工程菌的培养和 LGY 的诱导分泌表达 | 第53页 |
| ·表达产物 LGY 的 SDS-PAGE 分析 | 第53页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第53-54页 |
| ·标准曲线的绘制 | 第53-54页 |
| ·样品蛋白含量测定 | 第54页 |
| ·表达产物的生物学活性检测 | 第54-55页 |
| ·疏绵状嗜热丝胞菌脂肪酶 LGY 的定向进化 | 第55-58页 |
| ·突变体库的构建 | 第55-58页 |
| ·易错 PCR 及条件摸索 | 第55-56页 |
| ·构建突变体库 | 第56页 |
| ·定向进化酵母转化子的筛选 | 第56-57页 |
| ·定向进化酵母转化子的平板筛选 | 第56-57页 |
| ·小量发酵 | 第57页 |
| ·定向进化酵母转化子的复筛 | 第57页 |
| ·突变体表达酶液和原始酶液酶活比较 | 第57页 |
| ·两种酶液蛋白含量测定 | 第57页 |
| ·两种酶液酶活测定 | 第57页 |
| ·突变体序列测定 | 第57-58页 |
| ·疏绵状嗜热丝胞菌脂肪酶 LGY 的定点突变的方法 | 第58-60页 |
| ·定点突变 PCR 引物设计 | 第58页 |
| ·定点突变 PCR | 第58页 |
| ·PCR 产物消化 | 第58-59页 |
| ·转入大肠杆菌 DH5α | 第59页 |
| ·菌落 PCR 扩增 | 第59页 |
| ·突变体酵母表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达 | 第59页 |
| ·突变体的酶活测定 | 第59页 |
| ·蛋白三维结构分析 | 第59-60页 |
| 3 结果与分析 | 第60-76页 |
| ·疏绵状嗜热丝胞菌脂肪酶 LGY 在毕赤酵母中的表达结果 | 第60-67页 |
| ·脂肪酶 LGY 成熟肽基因序列的酶切位点分析和扩增 | 第60-61页 |
| ·脂肪酶 LGY 在毕赤酵母中的表达 | 第61-65页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第61-63页 |
| ·重组酵母表达质粒 pPIC9K/lgy 转化毕赤酵母及酵母转化子的筛选 | 第63-65页 |
| ·酵母转化子的甲醇利用表型的筛选 | 第63-64页 |
| ·酵母转化子的 PCR 鉴定 | 第64-65页 |
| ·基因酵母多拷贝整合子的筛选 | 第65页 |
| ·疏绵状嗜热丝胞菌脂肪酶 LGY 在毕赤酵母中的高效表达及表达产物的检测 | 第65-67页 |
| ·脂肪酶 LGY 在毕赤酵母中的诱导表达和高表达酵母菌株的筛选 | 第65-66页 |
| ·脂肪酶 LGY 蛋白表达纯化 | 第66-67页 |
| ·疏绵状嗜热丝胞菌脂肪酶基因 LGY 的分子改造试验结果 | 第67-72页 |
| ·突变体库的构建 | 第67-68页 |
| ·易错 PCR 条件摸索 | 第67-68页 |
| ·构建突变体库 | 第68页 |
| ·酵母转化子的筛选 | 第68-70页 |
| ·酵母转化子的平板筛选 | 第68-69页 |
| ·酵母转化子的复筛 | 第69-70页 |
| ·定向进化突变体测序 | 第70-72页 |
| ·定点突变确定作用位点与分析 | 第72-75页 |
| ·定点突变测序结果 | 第72页 |
| ·定点突变酵母菌落 PCR 鉴定及工程菌构建 | 第72-74页 |
| ·定点突变酵母工程菌表达蛋白的 SDS-PAGE 检测 | 第74-75页 |
| ·蛋白三维结构分析 | 第75-76页 |
| 4 讨论 | 第76-80页 |
| ·疏绵状嗜热丝胞菌脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第76-77页 |
| ·表达系统的选择 | 第76页 |
| ·表达载体的构建 | 第76-77页 |
| ·重组蛋白的分泌表达及纯化 | 第77页 |
| ·脂肪酶基因的分子改造 | 第77-80页 |
| 5 结论与建议 | 第80-82页 |
| ·结论 | 第80页 |
| ·建议 | 第80-82页 |
| 参考文献 | 第82-89页 |
| 致谢 | 第89页 |
