| 中文摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 缩略词表 | 第10-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-24页 |
| 1. PRRS的历史背景 | 第12页 |
| 2. PRRS流行病学概述 | 第12-13页 |
| 3. PRRSV的病原学特性 | 第13-15页 |
| ·PRRSV的分类及形态 | 第13-14页 |
| ·PRRSV的理化特性 | 第14页 |
| ·PRRSV的培养特性 | 第14页 |
| ·PRRSV的抗体依赖性增强作用(ADE) | 第14-15页 |
| 4. PRRSV基因组结构及编码的蛋白 | 第15-19页 |
| ·PRRSV基因组结构 | 第15-16页 |
| ·PRRSV基因组编码的蛋白 | 第16-19页 |
| ·非结构蛋白 | 第16-17页 |
| ·结构蛋白 | 第17-19页 |
| 5. PRRSV的抗原检测 | 第19-21页 |
| ·病毒的分离鉴定 | 第19-20页 |
| ·核酸探针原位杂交技术(ISH) | 第20页 |
| ·反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR) | 第20-21页 |
| ·实时荧光定量RT-PCR | 第21页 |
| 6. PRRSV的血清学诊断 | 第21-22页 |
| ·血清中和试验(SN) | 第21页 |
| ·免疫过氧化物酶单层试验(IPMA) | 第21页 |
| ·免疫荧光抗体染色技术(IFA) | 第21-22页 |
| ·酶联免疫吸附试验(ELISA) | 第22页 |
| ·乳胶凝集试验(LAT) | 第22页 |
| ·免疫胶体金技术 | 第22页 |
| 7. 本研究目的及意义 | 第22-24页 |
| 第二章 M基因的原核表达与间接ELISA方法的建立 | 第24-53页 |
| 1 材料与仪器 | 第24-25页 |
| ·毒株、菌种、质粒 | 第24页 |
| ·血清 | 第24页 |
| ·主要试剂 | 第24页 |
| ·主要仪器设备 | 第24页 |
| ·主要溶液的配置 | 第24-25页 |
| 2 方法 | 第25-38页 |
| ·重组克隆载体pMD19-T-dM的构建 | 第25-32页 |
| ·缺失跨膜区域的M蛋白(dM)基因的PCR引物设计 | 第25-27页 |
| ·PRRSV总RNA的提取 | 第27页 |
| ·PRRSV cDNA的合成 | 第27-28页 |
| ·dM基因的PCR扩增与鉴定 | 第28页 |
| ·PCR产物的回收与纯化 | 第28-29页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第29-30页 |
| ·PCR胶回收产物与pMD19-T simple vector的连接 | 第30页 |
| ·连接产物的转化 | 第30页 |
| ·重组阳性菌质粒的抽提 | 第30-31页 |
| ·重组质粒pMD19-T-dM的双酶切鉴定 | 第31页 |
| ·重组质粒pMD19-T-dM的序列测定与分析 | 第31-32页 |
| ·重组表达载体pET-32a-dM的构建 | 第32-33页 |
| ·dM基因片段与pET-32a(+)的双酶切与回收 | 第32页 |
| ·dM基因片段与pET-32a(+)的连接与转化 | 第32页 |
| ·重组表达载体pET-32a-dM的双酶切鉴定 | 第32页 |
| ·重组表达载体pET-32a-dM转化进Rosetta的鉴定 | 第32-33页 |
| ·PRRSV缺失跨膜区域的M蛋白(dM蛋白)的表达与分析 | 第33-36页 |
| ·重组蛋白不同诱导表达时间分析 | 第33页 |
| ·重组蛋白不同诱导表达温度分析 | 第33-34页 |
| ·重组蛋白不同诱导表达IPTG浓度分析 | 第34页 |
| ·重组蛋白的可溶性表达分析 | 第34页 |
| ·重组蛋白的纯化与复性 | 第34-35页 |
| ·纯化后重组蛋白浓度的测定 | 第35页 |
| ·重组蛋白的免疫印迹分析 | 第35-36页 |
| ·间接ELISA方法的操作程序 | 第36-37页 |
| ·间接ELISA方法工作条件的优化 | 第37页 |
| ·抗原最佳工作浓度和待检血清最佳稀释倍数的确定 | 第37页 |
| ·酶标二抗最佳稀释度的确定 | 第37页 |
| ·阳性和阴性临界值的确定 | 第37页 |
| ·特异性试验 | 第37-38页 |
| ·重复性试验 | 第38页 |
| ·批内重复性试验 | 第38页 |
| ·批间重复性试验 | 第38页 |
| ·间接ELISA方法与康百得试剂盒检测结果的比较分析 | 第38页 |
| 3 结果 | 第38-49页 |
| ·dM基因RT-PCR扩增结果 | 第38-39页 |
| ·重组质粒pMD19T-dM的双酶切鉴定 | 第39-40页 |
| ·重组质粒pMD19T-dM的序列测定 | 第40页 |
| ·重组表达质粒pET-32a-dM的双酶切鉴定 | 第40-41页 |
| ·重组蛋白不同诱导表达时间分析 | 第41页 |
| ·重组蛋白不同诱导表达温度分析 | 第41-42页 |
| ·重组蛋白不同诱导表达IPTG浓度分析 | 第42-43页 |
| ·重组蛋白可溶性分析与纯化 | 第43页 |
| ·重组蛋白免疫印迹分析 | 第43-44页 |
| ·间接ELISA方法工作条件的优化 | 第44-45页 |
| ·抗原最佳工作浓度和待检血清最佳稀释倍数的确定 | 第44-45页 |
| ·酶标二抗最佳稀释度的确定 | 第45页 |
| ·阳性和阴性临界值的确定 | 第45-46页 |
| ·特异性试验 | 第46页 |
| ·重复性试验 | 第46-47页 |
| ·批内重复性试验 | 第46-47页 |
| ·批间重复性试验 | 第47页 |
| ·间接ELISA方法与康百得试剂盒检测结果的比较分析 | 第47-49页 |
| 4 讨论 | 第49-53页 |
| ·PRRSV M蛋白的原核表达 | 第49-51页 |
| ·间接ELISA方法的初步建立 | 第51-53页 |
| 全文结论 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-59页 |
| 致谢 | 第59-60页 |
| 附录 | 第60页 |
