| 中文摘要 | 第1-16页 |
| ABSTRACT | 第16-19页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-48页 |
| 1 蛋白酶抑制剂概述 | 第19-24页 |
| ·蛋白酶抑制剂的分类及特征 | 第19-22页 |
| ·Bowman-Birk型抑制剂(BBI) | 第19-20页 |
| ·Kunitz型抑制剂 | 第20-21页 |
| ·PotatoⅠ型抑制剂 | 第21-22页 |
| ·蛋白酶抑制剂的生理功能 | 第22-23页 |
| ·营养积累 | 第22页 |
| ·调节体内蛋白酶活性 | 第22页 |
| ·抵御病虫害 | 第22-23页 |
| ·蛋白酶抑制剂的应用 | 第23-24页 |
| ·在转基因植物方面的应用 | 第23页 |
| ·在医学方面的应用 | 第23-24页 |
| 2 细胞自噬的研究进展 | 第24-38页 |
| ·细胞自噬的形态学特征及分类 | 第24-25页 |
| ·细胞自噬的信号调控 | 第25-31页 |
| ·MTOR复合物调控 | 第26-30页 |
| ·PI3K/Akt/mTOR信号通路 | 第28页 |
| ·AMPK/mTOR信号通路 | 第28页 |
| ·mTOR对细胞自噬的调控 | 第28-30页 |
| ·Beclin 1的复合体调控 | 第30-31页 |
| ·参与细胞自噬的相关分子及其功能 | 第31-35页 |
| ·细胞自噬研究方法 | 第35-37页 |
| ·电子显微镜 | 第35-36页 |
| ·Monodansylcadaverine染色 | 第36页 |
| ·细胞自噬的特异标志物 | 第36页 |
| ·GFP-LC3定位 | 第36页 |
| ·LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的转化 | 第36页 |
| ·Beclin 1的表达 | 第36-37页 |
| ·特异抑制剂 | 第37页 |
| ·细胞自噬与凋亡的关系 | 第37-38页 |
| 3 本研究的立题背景及意义 | 第38-40页 |
| ·研究背景 | 第38-39页 |
| ·研究目的与意义 | 第39-40页 |
| 4 参考文献 | 第40-48页 |
| 第二章 pExSecI-BTI载体的构建及纯化 | 第48-56页 |
| 1 实验材料 | 第48-49页 |
| ·菌株及质粒 | 第48页 |
| ·试剂及仪器 | 第48-49页 |
| 2 实验方法 | 第49-51页 |
| ·pExSecI-BTI表达载体的构建 | 第49-50页 |
| ·rBTI的表达与纯化 | 第50页 |
| ·rBTI表达条件的选择 | 第50-51页 |
| ·rBTI的纯化 | 第51页 |
| ·抑制活性的测定 | 第51页 |
| 3 实验结果 | 第51-54页 |
| ·pExSecI-BTI表达载体的构建 | 第51-52页 |
| ·pExSecI-BTI表达条件的优化 | 第52-53页 |
| ·表达产物的预处理 | 第53页 |
| ·rBTI纯化及纯度分析 | 第53-54页 |
| ·rBTI抑制胰蛋白酶活性的测定 | 第54页 |
| 4 讨论 | 第54-55页 |
| 5 参考文献 | 第55-56页 |
| 第三章 rBTI的内化机制 | 第56-70页 |
| 1 实验材料 | 第56-57页 |
| ·细胞株及试剂 | 第56页 |
| ·实验仪器 | 第56-57页 |
| ·实验试剂的配置 | 第57页 |
| 2 实验方法 | 第57-60页 |
| ·FITC标记rBTI | 第57-58页 |
| ·细胞培养 | 第58页 |
| ·激光共聚焦标本的制作 | 第58页 |
| ·rBTI最佳使用浓度的确定 | 第58页 |
| ·rBTI与转铁蛋白的共转运 | 第58-59页 |
| ·内吞抑制剂的使用 | 第59页 |
| ·M期阻滞对内吞的影响 | 第59页 |
| ·RNA干扰技术的应用 | 第59页 |
| ·rBTI与uPA在细胞表面的共定位 | 第59-60页 |
| 3 实验结果 | 第60-67页 |
| ·FITC-BTI以能量和浓度依赖性的方式进入细胞 | 第60页 |
| ·FITC-BTI可以和Rho-Tf同步内化 | 第60-61页 |
| ·膜电位消除对FITC-BTI内吞的影响 | 第61页 |
| ·内吞抑制剂的影响 | 第61-64页 |
| ·M期阻滞抑制了FITC-BTI的内吞 | 第64页 |
| ·FITC-BTI依赖网格蛋白 | 第64-65页 |
| ·FITC-BTI和细胞表面的uPA共定位 | 第65-67页 |
| 4 讨论 | 第67-68页 |
| 5 参考文献 | 第68-70页 |
| 第四章 rBTI诱导Hep G2细胞自噬 | 第70-82页 |
| 1 实验材料 | 第70-71页 |
| ·实验试剂与质粒 | 第70-71页 |
| ·实验仪器 | 第71页 |
| 2 实验方法 | 第71-73页 |
| ·细胞培养 | 第71页 |
| ·透射电镜观察 | 第71页 |
| ·rBTI作用后细胞形态的变化 | 第71页 |
| ·Hep G2细胞恢复实验 | 第71-72页 |
| ·MDC染色 | 第72页 |
| ·pCMV-GFP-LC3转染 | 第72-73页 |
| ·Hep G2细胞自噬的定量检测 | 第73页 |
| ·Hep G2细胞自噬对相关细胞器的影响 | 第73页 |
| 3 实验结果 | 第73-79页 |
| ·透射显微镜观察Hep G2自噬 | 第73-74页 |
| ·细胞形态观察 | 第74页 |
| ·Hep G2细胞恢复实验 | 第74-76页 |
| ·MDC染色观察细胞自噬 | 第76页 |
| ·GFP-LC3观察细胞自噬 | 第76-77页 |
| ·流式细胞术定量检测Hep G2细胞自噬 | 第77页 |
| ·Hep G2细胞自噬对相关细胞器的影响 | 第77-79页 |
| 4 讨论 | 第79-80页 |
| 5 参考文献 | 第80-82页 |
| 第五章 rBTI诱导Hep G2细胞自噬机制初探 | 第82-91页 |
| 1 实验材料 | 第82页 |
| 2 实验方法 | 第82-86页 |
| ·双色荧光载体构建 | 第82-83页 |
| ·rBTI在Hep G2细胞内的定位 | 第83页 |
| ·rBTI中WXXL模体的突变及活性鉴定 | 第83-84页 |
| ·自噬抑制剂3-MA的使用 | 第84页 |
| ·RNA水平检测自噬相关分子变化 | 第84-86页 |
| 3 实验结果 | 第86-90页 |
| ·pDsRed1-N1-EGFP-BTI荧光载体的构建 | 第86-87页 |
| ·rBTI分子中WXXL模体的功能 | 第87-88页 |
| ·3-MA在rBTI诱导的细胞自噬中的作用 | 第88页 |
| ·自噬相关基因的表达 | 第88-90页 |
| 4 讨论 | 第90页 |
| 5 参考文献 | 第90-91页 |
| 第六章 rBTI和uPA相互作用研究 | 第91-100页 |
| 1 实验材料 | 第91页 |
| 2 实验方法 | 第91-93页 |
| ·pGEX-6p-1-BTI载体的构建与纯化 | 第91-92页 |
| ·荧光光谱法检测rBTI与uPA的相互作用 | 第92页 |
| ·凝胶电泳分析rBTI与uPA的相互作用 | 第92页 |
| ·rBTI对Hep G2细胞uPA及相关酶表达的影响 | 第92-93页 |
| ·rBTI对细胞迁移的影响 | 第93页 |
| 3 实验结果 | 第93-98页 |
| ·pGEX-6p1-BTI的原核表达及纯化 | 第93-94页 |
| ·uPA与rBTI的相互作用 | 第94-95页 |
| ·凝胶电泳分析uPA与rBTI的相互作用 | 第95-96页 |
| ·rBTI对Hep G2细胞uPA及相关酶表达的影响 | 第96-97页 |
| ·rBTI对Hep G2细胞迁移的影响 | 第97-98页 |
| 4 测论 | 第98-99页 |
| 5 参考文献 | 第99-100页 |
| 小结与展望 | 第100-102页 |
| 附录 | 第102-107页 |
| 致谢 | 第107-109页 |
