| 中文摘要 | 第1-11页 |
| 英文摘要 | 第11-15页 |
| 前言 | 第15-27页 |
| 一.珠蛋白基因是研究成簇基因表达调控的良好模型 | 第15-17页 |
| 二.α-珠蛋白基因簇位处于开放的染色质环境 | 第17-18页 |
| 三.序列比对确定人α-珠蛋白基因簇的染色质结构域 | 第18-19页 |
| 四.α-珠蛋白基因簇上游调控元件功能仍未定论 | 第19-21页 |
| 五.α-珠蛋白基因簇的组织特异性及发育阶段特异性表达 | 第21-23页 |
| 1.α-珠蛋白基因簇的发育阶段特异性表达是自主的 | 第21-22页 |
| 2.α-珠蛋白基因簇的组织特异性表达可能主要由αPCE介导 | 第22-23页 |
| 六.BAC介导的转基因鼠是研究人α-珠蛋白基因簇表达调控的良好模型 | 第23-24页 |
| 七.本研究的主要内容 | 第24-27页 |
| 材料与方法 | 第27-56页 |
| 一.材料 | 第27-29页 |
| 1.含人α-珠蛋白基因簇BAC克隆 | 第27页 |
| 2.菌株与质粒 | 第27-28页 |
| 3.实验用小鼠 | 第28页 |
| 4.限制性内切酶与修饰酶 | 第28页 |
| 5.其它主要试剂 | 第28页 |
| 6.放射性核素 | 第28-29页 |
| 7.主要仪器设备 | 第29页 |
| 二.实验方法 | 第29-56页 |
| 1.利用突变BAC介导的转基因小鼠研究人α-类珠蛋白基因表达与调控的基本路线 | 第29页 |
| 2.含完整人的α-珠蛋白基因簇的BAC DNA的鉴定 | 第29-31页 |
| ·BAC DNA的小量制备 | 第29-31页 |
| ·BAC DNA的大量制备 | 第31页 |
| ·BAC DNA的末端直接测序 | 第31页 |
| 3.利用同源重组从含完整人α-珠蛋白基因簇的BAC DNA中分别定位删除两种序列:包含HS-33、HS-10、HS-8和HS-4高敏位点31.7kb DNA序列(αMⅡ);包含HS-40、HS-33、HS-10、HS-8和HS-4高敏位点35.4kb DNA序列(αMⅢ) | 第31-43页 |
| ·利用缺陷型λ原噬菌体介导的同源重组方法修饰BAC DNA以得到αM Ⅱ(HS-4～33删除) | 第32-37页 |
| ·技术路线 | 第32-33页 |
| ·用于重组的片段(A’box-Bsi WI-kanamycin-Bsi WI-B’box)的PCR扩增与PCR产物的回收 | 第33-34页 |
| ·DY380电转感受态细胞的制备 | 第34页 |
| ·DY380电转感受态细胞的BAC DNA转化 | 第34页 |
| ·含α-BAC DNA的DY380电转感受态细胞的制备 | 第34-35页 |
| ·缺陷型λ原噬菌体介导的同源重组 | 第35页 |
| ·重组体(αM ⅡR1)的鉴定 | 第35页 |
| ·重组体(αM Ⅱ R1)上抗性基因的去除 | 第35-36页 |
| ·限制性内切酶切割及PFGE分析鉴定αM Ⅱ BAC突变体 | 第36页 |
| ·序列分析鉴定αM Ⅱ BAC突变体接头 | 第36页 |
| ·Southern杂交鉴定αM Ⅱ BAC突变体 | 第36-37页 |
| ·利用温度敏感型穿梭载体介导的同源重组方法修饰BAC DNA以得到αM Ⅲ(HS-4～40删除) | 第37-43页 |
| ·技术路线 | 第37-38页 |
| ·穿梭载体的构建 | 第38页 |
| ·突变盒序列的PCR扩增与PCR产物的回收 | 第38-40页 |
| ·连接反应 | 第40页 |
| ·感受态细胞制备 | 第40页 |
| ·感受态细胞的转化 | 第40-41页 |
| ·克隆筛选 | 第41页 |
| ·pSV-RecA温度敏感型穿梭载体质粒的酶切及脱磷酸化处理 | 第41页 |
| ·温度敏感型穿梭载体pSV-RecA-AB的获得 | 第41-42页 |
| ·含有BAC DNA的感受态细胞的制备 | 第42页 |
| ·感受态细胞的转化及重组体的正-筛选 | 第42页 |
| ·镰孢菌酸(FA)负筛选确定突变BAC克隆 | 第42页 |
| ·酶切及PFGE分析鉴定αM Ⅲ BAC突变体 | 第42页 |
| ·连接处序列测定分析鉴定αM Ⅲ BAC突变体 | 第42-43页 |
| ·Southern杂交鉴定αM Ⅲ BAC突变体 | 第43页 |
| 4.显微注射用BAC DNA的制备与纯化 | 第43页 |
| 5.受精卵培养基的配制与保存 | 第43-45页 |
| ·贮存液的成分及配制 | 第43页 |
| ·M2和M16工作液的配制 | 第43-45页 |
| 6.小鼠的选择与处理 | 第45-47页 |
| 7.超排卵与取卵 | 第47页 |
| 8.显微注射 | 第47-48页 |
| ·持卵针的制备 | 第47页 |
| ·显微注射针的拉制 | 第47页 |
| ·显微注射室的制备 | 第47-48页 |
| ·显微注射 | 第48页 |
| 9.输卵管移卵 | 第48-50页 |
| 10.鼠尾基因组DNA的提取 | 第50-51页 |
| 11.利用PCR和Southern杂交鉴定转基因鼠 | 第51页 |
| ·PCR法鉴定转基因鼠 | 第51页 |
| ·Southern杂交鉴定转基因鼠 | 第51页 |
| 12.转基因鼠传代 | 第51-52页 |
| 13.胚胎小鼠器官组织的采集和保存 | 第52页 |
| 14.阳性胎鼠的PCR快速鉴定 | 第52页 |
| 15.组织RNA提取 | 第52-53页 |
| ·12.5天孕期以后的组织RNA提取 | 第52-53页 |
| ·10.5天孕期以前的红系组织(卵黄囊)RNA提取 | 第53页 |
| 16.RNase保护实验检测转基因小鼠中人α-类珠蛋白转基因的表达 | 第53-56页 |
| ·RNA探针标记 | 第53-54页 |
| ·RNA探针的纯化 | 第54页 |
| ·RNA∶RNA杂交 | 第54页 |
| ·RNase反应、变性胶电泳及放射自显影 | 第54-56页 |
| 实验结果 | 第56-84页 |
| 一.α-BAC克隆的末端直接测序结果 | 第56-57页 |
| 二.αM Ⅱ BAC突变体(HS-4～33删除)的鉴定结果 | 第57-60页 |
| 1.重组体(αM Ⅱ R1)的酶切及PFGE分析鉴定结果 | 第57页 |
| 2.αM Ⅱ的酶切及PFGE分析鉴定结果 | 第57-58页 |
| 3.αM Ⅱ BAC删除点连接处测序结果 | 第58-59页 |
| 4.αM Ⅱ Southern杂交鉴定结果 | 第59-60页 |
| 三.αM Ⅲ BAC突变体(HS-4～40删除)的鉴定结果 | 第60-66页 |
| 1.温度敏感型穿梭载体pSV-RecA-AB的构建结果 | 第60-62页 |
| 2.重组体的正负筛选 | 第62-63页 |
| 3.αM Ⅲ的酶切及PFGE分析鉴定结果 | 第63页 |
| 4.αM Ⅲ删除点连接处测序结果 | 第63-65页 |
| 5.αM Ⅲ酶切和Southern杂交鉴定结果 | 第65-66页 |
| 四.显微注射用BAC DNA的制备与纯化 | 第66-67页 |
| 五.转基因鼠系的建立 | 第67-68页 |
| 1.转基因鼠PCR检测结果 | 第67页 |
| 2.转基因鼠Southern杂交检测结果 | 第67-68页 |
| 六.人α-珠蛋白在转基因鼠中的表达 | 第68-84页 |
| 1.αM Ⅰ转基因小鼠中人α-类珠蛋白基因表达分析 | 第68-75页 |
| 2.αM Ⅱ转基因小鼠中人α-类珠蛋白基因表达分析 | 第75-81页 |
| 3.αM Ⅲ转基因小鼠中人α-类珠蛋白基因表达分析 | 第81-84页 |
| 讨论 | 第84-99页 |
| 一用于修饰BAC克隆的方法 | 第84-86页 |
| 二.人α-类珠蛋白基因在转基因鼠中的表达不干扰内源α-类珠蛋白基因的表达水平 | 第86-87页 |
| 三.人α-类珠蛋白基因的表达模式至少不依赖于某单一上游调控元件 | 第87-89页 |
| 1.HS-40的删除不影响人α-类珠蛋白基因的表达模式 | 第87-88页 |
| 2.HS-4～33的删除不影响人α-类珠蛋白基因的表达模式 | 第88页 |
| 3.人α-类珠蛋白基因的表达模式至少不依赖于某单一上游调控元件 | 第88-89页 |
| 四.上游调控元件以成环(loop)作用机制调控人α-珠蛋白基因簇的转录表达 | 第89-96页 |
| 1.HS-40对于人α-类珠蛋白基因的在转录水平上的表达具有重要作用 | 第89-90页 |
| 2.HS-4～33的删除对人ζ-和人α-珠蛋白基因表达水平影响不同 | 第90-91页 |
| 3.HS-4～40全部高敏位点删除后人α-类珠蛋白转基因不表达 | 第91-92页 |
| 4.任一高敏位点都不足以单独指导人α-珠蛋白基因簇的表达 | 第92-94页 |
| 5.上游调控元件以成环(loop)作用机制调控人α-珠蛋白基因簇的转录表达 | 第94-96页 |
| 五.不足及展望 | 第96-99页 |
| 小结 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-110页 |
| 文献综述(一) | 第110-125页 |
| 文献综述(二) | 第125-136页 |
| 英文名词及缩写 | 第136-138页 |
| 致谢 | 第138-139页 |
| 个人简历 | 第139页 |
