| 中文摘要 | 第1-9页 |
| 英文摘要 | 第9-11页 |
| 第一章引言 | 第11-23页 |
| 第一节 白斑综合征病毒(WSSV)及基因组和结构蛋白研究概况 | 第11-14页 |
| 1 白斑综合征病毒(WSSV)概述 | 第11-12页 |
| ·白斑综合征病毒(WSSV)结构 | 第11页 |
| ·白斑综合征病毒(W SSV)生物学特点 | 第11-12页 |
| 2 白斑综合征病毒(WSSV)基因组学及结构蛋白的研究 | 第12-14页 |
| ·白斑综合征病毒(WSSV)基因组 | 第12页 |
| ·白斑综合征病毒(WSSV)结构蛋白研究 | 第12-14页 |
| 第二节 毕赤酵母表达系统及影响其表达外源基因的因素 | 第14-19页 |
| 1 巴氏毕赤酵母表达系统 | 第14-16页 |
| ·巴氏毕赤酵母表达外源蛋白的优势 | 第14-15页 |
| ·巴氏毕赤酵母表达宿主菌 | 第15页 |
| ·巴氏毕赤酵母表达载体 | 第15-16页 |
| 2 影响毕赤酵母表达外源基因的因素 | 第16-19页 |
| ·表达载体的影响 | 第17-18页 |
| ·启动子影响 | 第17页 |
| ·信号肽 | 第17-18页 |
| ·表达框的染色体整合位点和方式 | 第18页 |
| ·目的基因的影响 | 第18-19页 |
| ·基因密码子偏好性 | 第18页 |
| ·基因A+T含量 | 第18页 |
| ·目的基因拷贝数 | 第18-19页 |
| ·外部条件影响 | 第19页 |
| 参考文献 | 第19-23页 |
| 第二章 白斑综合征病毒VAP1基因的改造及合成 | 第23-34页 |
| 第一节 VAP1氨基酸序列功能和结构分析 | 第23-27页 |
| 1 方法 | 第23页 |
| 2 结果 | 第23-25页 |
| ·基序(模序)位点分析 | 第23-24页 |
| ·结构信息 | 第24-25页 |
| ·氨基酸组成分析 | 第24页 |
| ·二级结构组成分析 | 第24页 |
| ·二硫键分析 | 第24页 |
| ·跨膜分析 | 第24-25页 |
| ·同源建模 | 第25页 |
| 3 讨论 | 第25-27页 |
| 第二节 VAP1part基因序列分析和改造及人工合成 | 第27-32页 |
| 1 VAP1part基因序列的分析和改造 | 第27-30页 |
| ·毕赤酵母偏好密码子分析和基因的改造 | 第27-28页 |
| ·依据 | 第27页 |
| ·改造及结果 | 第27-28页 |
| ·碱基含量分析和基因的改造 | 第28页 |
| ·依据 | 第28页 |
| ·改造及结果 | 第28页 |
| ·酶切位点分析和基因的改造 | 第28-29页 |
| ·依据 | 第28-29页 |
| ·改造及结果 | 第29页 |
| ·mRNA二级结构分析 | 第29页 |
| ·星号活性分析和基因的改造 | 第29页 |
| ·依据 | 第29页 |
| ·改造及结果 | 第29页 |
| ·内含子分析和基因的改造1.6内含子分析和基因的改造 | 第29-30页 |
| ·依据 | 第29-30页 |
| ·改造及结果 | 第30页 |
| 2 基因修改序列验证 | 第30-31页 |
| ·G+C含量 | 第30页 |
| ·VAP1part基因的氨基酸序列验证 | 第30-31页 |
| 3 VAP1part基因的人工合成 | 第31页 |
| 4 讨论 | 第31-32页 |
| 参考文献 | 第32-34页 |
| 第三章 白斑综合征病毒(WSSV) VAP1part基因的克隆及毕赤酵母工程菌的构建 | 第34-56页 |
| 第一节白斑综合征病毒(WSSV) vAP1part基因的亚克隆 | 第34-45页 |
| 1 材料方法 | 第34-40页 |
| ·材料和试剂 | 第34页 |
| ·质粒与菌种 | 第34页 |
| ·主要仪器与化学试剂 | 第34页 |
| ·引物 | 第34页 |
| ·方法 | 第34-40页 |
| ·pUC57CS一VAP1part的获得 | 第35页 |
| ·表达质粒pGAPZ α A的获得 | 第35-36页 |
| ·质粒 DNA的定量 | 第36页 |
| ·质粒pUCS了CS-VAP1part和质粒 pGAPZαA的双酶切 | 第36页 |
| ·质粒pUC57CS-VAP1Part和质粒pGAPZ αA的双酶切产物分析定量及胶回收纯化 | 第36-38页 |
| ·pGAPZ αA一VAP1part的构建 | 第38页 |
| ·大肠杆菌 DH5α超级感受态细胞制备及pGAPZ αA一VAP1Part的转化. | 第38-39页 |
| ·重组质粒的菌落 PCR鉴定 | 第39-40页 |
| ·重组质粒的双酶切鉴定 | 第40页 |
| ·重组质粒pGAPZαA-VAP1part测序 | 第40页 |
| 2 结果 | 第40-44页 |
| ·VAP1Part基因的亚克隆 | 第40-43页 |
| ·质粒 DNA的定量及分析 | 第40-42页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌 DH5α | 第42-43页 |
| ·重组质粒的筛选鉴定 | 第43-44页 |
| ·菌落 PCR 筛选含有重组子菌落 | 第43页 |
| ·重组质粒的双酶切分析鉴定 | 第43页 |
| ·重组质粒的 DNA 序列测定. | 第43-44页 |
| 3 讨论 | 第44-45页 |
| 第二节 白斑综合征病毒(WSSV)VAP1part基因在毕赤酵母中的分泌表达 | 第45-56页 |
| 1 材料方法 | 第45-50页 |
| ·材料试剂 | 第45页 |
| ·质粒与菌株 | 第45页 |
| ·主要仪器与化学试剂 | 第45页 |
| ·引物 | 第45页 |
| ·方法 | 第45-50页 |
| ·重组质粒的扩增与酶切 | 第45-46页 |
| ·重组质粒转化毕赤酵母 | 第46页 |
| ·重组毕赤酵母的 PCR 鉴定 | 第46-48页 |
| ·重组毕赤酵母表达产物检测 | 第48-50页 |
| ·重组毕赤酵母的快速筛选 | 第50页 |
| 2. 结果 | 第50-54页 |
| ·重组毕赤酵母的 PCR 鉴定 | 第50-51页 |
| ·重组毕赤酵母的菌落 PCR 鉴定 | 第50-51页 |
| ·重组毕赤酵母的基因组 PCR 鉴定 | 第51页 |
| ·表达产物的 SDS一PAGE 分析 | 第51-52页 |
| ·表达产物的 Western 分析 | 第52页 |
| ·表达产物的 ELISA 分析 | 第52-53页 |
| ·重组毕赤酵母的快速筛选 | 第53-54页 |
| 3 讨论 | 第54-56页 |
| 第四章 毕赤酵母实验室规模简易扩大培养装置及发酵效果初探 | 第56-66页 |
| 第一节 发酵装置设计及基本操作 | 第56-59页 |
| 1 设计构思 | 第56页 |
| 2 解决方案 | 第56页 |
| ·发酵体积 | 第56页 |
| ·培养方式 | 第56页 |
| ·充气及空气除菌 | 第56页 |
| ·控温 | 第56页 |
| ·设备灭菌 | 第56页 |
| 3 基本结构流程 | 第56-57页 |
| 4 操作流程 | 第57-58页 |
| 5 结果 | 第58页 |
| 6 讨论 | 第58-59页 |
| 第二节毕赤酵母实验室简易扩大培养 | 第59-65页 |
| 1 材料设备 | 第59页 |
| 2 方法 | 第59-60页 |
| ·简易扩大培养基本流程 | 第59-60页 |
| ·消泡剂使用效果比较研究 | 第60页 |
| ·酸碱度、吸光度、菌体湿重的测定 | 第60页 |
| ·计算毕赤酵母生长速率 | 第60页 |
| 3 结果 | 第60-64页 |
| ·消泡剂使用效果比较 | 第60-61页 |
| ·菌体生长过吸收值变化(生长曲线) | 第61-62页 |
| ·菌体湿重变化 | 第62-63页 |
| ·菌液吸光值与菌体湿重相关性分析 | 第63页 |
| ·培养液 pH变化 | 第63-64页 |
| ·毕赤酵母生长速率 | 第64页 |
| 4 讨论 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-66页 |
| 附录一 本论文所使用的培养基和试剂配制 | 第66-70页 |
| 附录二 发酵常用消泡剂及特点 | 第70-71页 |
| 附录三 重组质粒的构建 | 第71-72页 |
| 致谢 | 第72页 |
