| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 1 文献综述 | 第11-28页 |
| 1．1 丹参概述 | 第11-15页 |
| 1．1．1 丹参的形态特征及资源分布 | 第11页 |
| 1．1．2 丹参的药物学研究 | 第11-13页 |
| 1．1．3 丹参资源应用和利用现状 | 第13-14页 |
| 1．1．4 丹参分子生物学研究现状 | 第14-15页 |
| 1．2 表达序列标签(EST)技术的研究和应用进展 | 第15-20页 |
| 1．2．1 EST技术的原理和方法 | 第15-16页 |
| l．2．2 EST技术的形成 | 第16页 |
| 1．2．3 EST数据库 | 第16-17页 |
| l．2．4 EST序列的分析 | 第17页 |
| 1．2．5 EST在功能基因组学研究上的应用 | 第17-19页 |
| 1．2．6 EST技术的不足之处及解决策略 | 第19-20页 |
| 1．3 植物外源基因转化的研究进展 | 第20-26页 |
| 1．3．1 植物遗传转化的历史及研究现状 | 第20页 |
| 1．3．2 农杆菌的生物学特性及 T- DNA的转移 | 第20-22页 |
| 1．3．3 受体系统的建立及要考虑的因素 | 第22-24页 |
| 1．3．4 植物基因转化系统的建立及影响因素 | 第24-26页 |
| 1．4 本研究的目的和意义 | 第26-28页 |
| 1．4．1 研究的必要性和意义 | 第26-28页 |
| 1．4．2 研究内容及目的 | 第28页 |
| 2 材料与方法 | 第28-46页 |
| 2．1 基因克隆的材料与方法 | 第28-40页 |
| 2．1．1 材料与试剂 | 第28-33页 |
| 2．1．2 方法 | 第33-40页 |
| 2．1．2．1 材料处理 | 第33页 |
| 2．1．2．2 丹参总 RNA提取方法的比较与优化 | 第33-35页 |
| 2．1．2．3 mRNA的分离纯化 | 第35页 |
| 2．1．2．4 RNA琼脂糖凝胶电泳快速检测 | 第35页 |
| 2．1．2．5 cDNA文库构建及转化菌体保存 | 第35-38页 |
| 2．1．2．6 质粒的大规模提取 | 第38-39页 |
| 2．1．2．7 DNA测序 | 第39-40页 |
| 2．1．2．8 序列处理 | 第40页 |
| 2．1．2．9 EST序列拼接 | 第40页 |
| 2．1．2．10 Unigene序列注释 | 第40页 |
| 2．1．2．11 Unigene的 GO分类和 PATHWAY分类分析 | 第40页 |
| 2．2 基因转化的材料与方法 | 第40-46页 |
| 2．2．1 植物材料 | 第40-41页 |
| 2．2．2 供试质粒及菌株 | 第41页 |
| 2．2．3 农杆菌的培养和菌液制备 | 第41-42页 |
| 2．2．4 实验方法 | 第42-45页 |
| 2．2．4．1 丹参转化的培养条件 | 第42页 |
| 2．2．4．2 丹参基因转化受体系统的优化 | 第42-43页 |
| 2．2．4．3 丹参外植体对卡那霉素的敏感性测试 | 第43页 |
| 2．2．4．4 遗传转化及相关参数的筛选及优化 | 第43-44页 |
| 2．2．4．5 转化体的鉴定 | 第44-45页 |
| 2．2．4．6 转化效率的统计 | 第45页 |
| 2．2．5 数据统计 | 第45-46页 |
| 3 结果与分析 | 第46-76页 |
| 3．1 基因克隆 | 第46-67页 |
| 3．1．1 高质量丹参总 RNA提取方法的建立 | 第46-47页 |
| 3．1．2 mRNA的分离纯化 | 第47页 |
| 3．1．3 cDNA文库构建 | 第47页 |
| 3．1．4 质粒的大规模提取 | 第47-48页 |
| 3．1．5 cDNA5'端大规模测序及序列拼接 | 第48-50页 |
| 3．1．6 Unigene的注释 | 第50-53页 |
| 3．1．7 Unigene的分类 | 第53-58页 |
| 3．1．8 基于 EST的丹参文库特征和各种基因的获得 | 第58-67页 |
| 3．1．8．1 Digital Northern分析及丰富表达的基因 | 第58-59页 |
| 3．1．8．2 丹参逆境胁迫相关基因分析 | 第59-60页 |
| 3．1．8．3 丹参外源物质生物降解相关基因分析 | 第60页 |
| 3．1．8．4 丹参次生代谢相关基因分析 | 第60-62页 |
| 3．1．8．5 转录调节相关基因的分析 | 第62-67页 |
| 3．2 基因转化 | 第67-76页 |
| 3．2．1 受体再生系统的优化 | 第67-68页 |
| 3．2．2 转化体系的建立 | 第68-76页 |
| 3．2．2．1 适宜抗生素浓度的筛选及选择压的确定 | 第68-70页 |
| 3．2．2．2 不同预培养时间对转化的影响 | 第70页 |
| 3．2．2．3 不同农杆菌浓度对转化的影响 | 第70-71页 |
| 3．2．2．4 不同浸染时间对农杆菌转化的影响 | 第71-72页 |
| 3．2．2．5 AS对转化效率的影响 | 第72页 |
| 3．2．2．6 不同共培养时间及光照条件对转化的影响 | 第72-73页 |
| 3．2．2．7 不同菌株和载体类型对转化的影响 | 第73-74页 |
| 3．2．2．8 转化体的鉴定 | 第74-76页 |
| 3．2．2．9 转化率的分析 | 第76页 |
| 3．2．2．10 本实验建立的丹参的转化流程 | 第76页 |
| 4 讨论 | 第76-88页 |
| 4．1 丹参基因克隆的方法选择 | 第76-78页 |
| 4．2 构建丹参cDNA文库所用丹参材料的选择 | 第78-79页 |
| 4．3 文库的质量 | 第79-80页 |
| 4．4 文库的特点 | 第80-81页 |
| 4．5 针对 EST的现有生物信息学分析的缺陷和改进方法 | 第81-82页 |
| 4．6 影响丹参转化率的因素 | 第82-84页 |
| 4．7 本研究建立的丹参转化体系的特点 | 第84页 |
| 4．8 丹参基因转化存在的问题 | 第84-85页 |
| 4．9 以后的研究方向和发展思路 | 第85-88页 |
| 总结 | 第88-89页 |
| 参考文献 | 第89-96页 |
| 致谢 | 第96-97页 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 | 第97-98页 |
