| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-16页 |
| 第1章 引言 | 第16-26页 |
| ·研究背景 | 第16-17页 |
| ·研究进展 | 第17-23页 |
| ·肝素酶的来源 | 第17页 |
| ·肝素酶的作用机理 | 第17-18页 |
| ·肝素酶的表达研究 | 第18-19页 |
| ·肝素酶的分离纯化 | 第19-20页 |
| ·肝素酶的酶学性质 | 第20-21页 |
| ·响应面法优化肝素酶发酵培养基 | 第21页 |
| ·肝素酶的应用 | 第21-23页 |
| ·肝素酶在制备低分子量肝素(LMWH)中的应用 | 第21-22页 |
| ·体外循环中消除肝素 | 第22-23页 |
| ·研究肝素的精确结构和低聚寡糖活性筛选 | 第23页 |
| ·药用研究 | 第23页 |
| ·研究目的和意义 | 第23-24页 |
| ·研究内容 | 第24-25页 |
| ·肝素酶重组表达载体的构建 | 第24页 |
| ·肝素酶基因在大肠杆菌中的表达研究 | 第24页 |
| ·重组肝素酶发酵培养基成分的优化 | 第24页 |
| ·肝素酶的分离纯化 | 第24页 |
| ·重组肝素酶酶学性质的研究 | 第24-25页 |
| ·技术路线 | 第25-26页 |
| 第2章 肝素酶原核表达载体pET-28a-Hpa Ⅰ的构建 | 第26-42页 |
| ·材料 | 第26-29页 |
| ·菌株和质粒 | 第26页 |
| ·培养基 | 第26页 |
| ·试剂 | 第26-28页 |
| ·质粒提取试剂 | 第26-27页 |
| ·其它试剂 | 第27-28页 |
| ·试剂盒 | 第28页 |
| ·限制性内切酶及工具酶 | 第28页 |
| ·核酸分子量标准 | 第28页 |
| ·仪器设备 | 第28-29页 |
| ·实验方法 | 第29-37页 |
| ·肝素黄杆菌基因组DNA的提取 | 第29-30页 |
| ·pET-28a质粒的提取 | 第30页 |
| ·肝素黄杆菌肝素酶Hpa Ⅰ基因的扩增 | 第30-32页 |
| ·引物的设计 | 第30-31页 |
| ·PCR扩增体系参数 | 第31-32页 |
| ·PCR扩增程序 | 第32页 |
| ·PCR产物的纯化回收 | 第32页 |
| ·重组质粒pET-28a-Hpa Ⅰ基因的构建 | 第32-35页 |
| ·PCR产物的双酶切 | 第32-33页 |
| ·pET-28a载体双酶切 | 第33页 |
| ·双酶切产物的回收 | 第33-34页 |
| ·用T4 DNA连接酶将载体pET-28a和Hpa Ⅰ进行连接 | 第34页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第34-35页 |
| ·连接产物的转化 | 第35页 |
| ·重组转化质粒的鉴定 | 第35-37页 |
| ·重组质粒的提取 | 第35-36页 |
| ·原核表达载体pET-28a-Hpa Ⅰ的鉴定 | 第36-37页 |
| ·结果分析 | 第37-41页 |
| ·Hpa Ⅰ基因的获取 | 第37-38页 |
| ·pET-28a载体和Hpa Ⅰ基因双酶切 | 第38页 |
| ·pET-28a-Hpa Ⅰ重组质粒的构建 | 第38页 |
| ·重组质粒pET-28a-Hpa Ⅰ的PCR鉴定 | 第38-39页 |
| ·重组质粒pET-28a-Hpa Ⅰ的双酶切鉴定 | 第39-40页 |
| ·测序结果及分析 | 第40-41页 |
| ·本章小结 | 第41-42页 |
| 第3章 黄杆菌肝素酶基因在大肠杆菌中的表达研究 | 第42-48页 |
| ·材料 | 第42-43页 |
| ·菌株 | 第42页 |
| ·试剂 | 第42-43页 |
| ·培养基 | 第42页 |
| ·其它试剂 | 第42-43页 |
| ·仪器设备 | 第43页 |
| ·实验方法 | 第43-46页 |
| ·重组质粒BL21-pET-28a-Hpa Ⅰ的诱导表达 | 第43-44页 |
| ·肝素酶活性的测定 | 第44-45页 |
| ·肝素酶活标准曲线的建立 | 第44-45页 |
| ·肝素酶活性测定方法 | 第45页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE分析 | 第45-46页 |
| ·SDS-PAGE电泳使用溶液 | 第45-46页 |
| ·SDS聚丙烯酰胺凝胶的制备 | 第46页 |
| ·SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第46页 |
| ·结果与分析 | 第46-47页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE | 第46-47页 |
| ·本章小结 | 第47-48页 |
| 第4章 培养基成分的优化 | 第48-60页 |
| ·材料 | 第48-49页 |
| ·实验菌株 | 第48页 |
| ·培养基 | 第48页 |
| ·试剂 | 第48-49页 |
| ·主要仪器设备 | 第49页 |
| ·实验方法 | 第49-51页 |
| ·部分因子实验设计 | 第49-50页 |
| ·Box-Behnken实验设计 | 第50页 |
| ·测定方法 | 第50-51页 |
| ·粗酶液的制备 | 第50页 |
| ·酶活的测定 | 第50-51页 |
| ·蛋白质的定量 | 第51页 |
| ·实验结果 | 第51-58页 |
| ·蛋白标准曲线的制作 | 第51-52页 |
| ·部分因子实验设计 | 第52-54页 |
| ·Box-Behnken实验设计 | 第54-58页 |
| ·本章小结 | 第58-60页 |
| 第5章 肝素酶的纯化及酶学性质研究 | 第60-70页 |
| ·材料 | 第60-63页 |
| ·实验菌株 | 第60页 |
| ·培养基 | 第60页 |
| ·试剂 | 第60-63页 |
| ·亲和纯化试剂 | 第60-61页 |
| ·其他试剂 | 第61-63页 |
| ·试剂盒 | 第63页 |
| ·实验方法 | 第63-66页 |
| ·重组蛋白的大量表达与样品制备 | 第63页 |
| ·Ni-NTA柱纯化融合蛋白 | 第63页 |
| ·Ni-NTA柱的再生 | 第63-64页 |
| ·分子量测定 | 第64页 |
| ·温度肝素酶活性的影响及其热稳定性研究 | 第64-65页 |
| ·pH对肝素酶活性的影响及其酸碱稳定性研究 | 第65页 |
| ·金属离子种类与强度对几丁质酶活性的影响 | 第65-66页 |
| ·结果与讨论 | 第66-68页 |
| ·His融合蛋白的纯化及分子量测定 | 第66页 |
| ·温度对肝素酶活性的影响及其热稳定性研究 | 第66-67页 |
| ·pH对酶活性的影响及其酸碱稳定性研究 | 第67-68页 |
| ·金属离子种类对肝素酶活性的影响 | 第68页 |
| ·本章小结 | 第68-70页 |
| 第6章 结论 | 第70-74页 |
| ·结论 | 第70-71页 |
| ·进一步研究的内容和建议 | 第71页 |
| ·研究展望 | 第71-74页 |
| ·不稳定性 | 第71页 |
| ·表达体系 | 第71-72页 |
| ·融合表达 | 第72页 |
| ·糖基化 | 第72-74页 |
| 参考文献 | 第74-82页 |
| 研究生期间发表的论文 | 第82-84页 |
| 致谢 | 第84-85页 |
