| 中文摘要 | 第1-14页 |
| Abstract | 第14-18页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-47页 |
| 一、初情期启动相关基因的研究进展 | 第18-37页 |
| 1 初情期启动的概述 | 第18-19页 |
| 2 NPY的研究进展 | 第19-26页 |
| ·NPY的发现 | 第19页 |
| ·NPY结构及分布 | 第19-20页 |
| ·NPY受体 | 第20-21页 |
| ·NPY的生物学功能 | 第21-26页 |
| 3 瘦素的研究进展 | 第26-34页 |
| ·leptin研究的历史 | 第26页 |
| ·leptin的结构与功能 | 第26-27页 |
| ·leptin与能量平衡 | 第27-28页 |
| ·leptin与生殖激素 | 第28页 |
| ·leptin与生殖发育 | 第28-30页 |
| ·leptin与初情期启动 | 第30-31页 |
| ·leptin受体的研究 | 第31-34页 |
| 4 GPR54的研究进展 | 第34-37页 |
| ·GPR54的发现与分子结构 | 第34页 |
| ·GPR54的分布 | 第34-35页 |
| ·GPR54的信号转导途径 | 第35页 |
| ·GPR54对动物生殖的影响 | 第35-37页 |
| 二、差异显示技术及其在动物繁殖新技术上的应用进展 | 第37-46页 |
| 1 DDRT-PCR的原理 | 第37页 |
| 2 DDRT-PCR的引物设计 | 第37-39页 |
| ·锚定引物 | 第37-38页 |
| ·随机引物 | 第38-39页 |
| 3 DDRT-PCR参数的优化 | 第39-40页 |
| ·保证起始(模板)mRNA的质量与浓度 | 第39页 |
| ·降低dNTP浓度 | 第39页 |
| ·选择最适的反转录和PCR退火温度 | 第39-40页 |
| 4 DDRT-PCR假阳性的鉴定方法 | 第40-41页 |
| 5 应用非放射性同位素mRNA差异显示技术 | 第41-42页 |
| 6 DDRT-PCR的发展 | 第42-43页 |
| 7 DDRT-PCR的优点与局限性 | 第43-44页 |
| 8 DDRT-PCR技术在猪繁育方面的应用 | 第44-46页 |
| ·在猪初情期启动方面的应用 | 第44页 |
| ·在猪胚胎、个体发育研究中的应用 | 第44页 |
| ·在猪繁殖方面的应用 | 第44-46页 |
| 三、研究目的与意义 | 第46-47页 |
| 第二章 猪NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb基因的克隆与分析 | 第47-61页 |
| 1 材料与方法 | 第47-54页 |
| ·实验材料 | 第47-48页 |
| ·实验动物 | 第47页 |
| ·质粒、菌株 | 第47页 |
| ·主要试剂 | 第47页 |
| ·主要仪器 | 第47-48页 |
| ·实验方法 | 第48-54页 |
| ·实验前准备工作 | 第48页 |
| ·样品的采集 | 第48页 |
| ·RNA的提取与检测 | 第48-49页 |
| ·RT-PCR | 第49-50页 |
| ·PCR反应 | 第50-52页 |
| ·克隆测序 | 第52-54页 |
| ·序列分析 | 第54页 |
| ·相关软件 | 第54页 |
| 2 结果与分析 | 第54-58页 |
| ·总RNA的检测 | 第54页 |
| ·NPY-Y1基因的克隆与分析 | 第54-56页 |
| ·NPY-Y1基因的扩增 | 第54-55页 |
| ·NPY-Y1基因测序 | 第55页 |
| ·NPY-Y1基因序列分析 | 第55-56页 |
| ·GPR54基因cDNA的克隆与序列分析 | 第56-57页 |
| ·RT-PCR结果 | 第56页 |
| ·GPR54基因测序 | 第56-57页 |
| ·GPR54基因序列分析 | 第57页 |
| ·Ob-Rb基因的克隆与分析 | 第57-58页 |
| ·Ob-Rb基因的扩增 | 第57页 |
| ·Ob-Rb基因测序 | 第57-58页 |
| ·Ob-Rb基因序列分析 | 第58页 |
| 3 讨论 | 第58-61页 |
| ·高保真Pfu的忠实性 | 第58页 |
| ·初情期启动的相关激素、肽和神经递质 | 第58-59页 |
| ·NPY-Y1基因 | 第59页 |
| ·GPR54基因 | 第59-60页 |
| ·Ob-Rb基因 | 第60-61页 |
| 第三章 猪初情期前后相关基因在下丘脑-垂体-卵巢轴内的表达定位 | 第61-73页 |
| 1 材料与方法 | 第61-64页 |
| ·实验动物 | 第61页 |
| ·主要试剂 | 第61页 |
| ·主要仪器 | 第61-62页 |
| ·样品的采集 | 第62页 |
| ·冰冻切片的制备 | 第62页 |
| ·器皿处理 | 第62页 |
| ·载玻片包被 | 第62页 |
| ·切片 | 第62页 |
| ·原位杂交(ISH) | 第62-63页 |
| ·免疫组化 | 第63-64页 |
| 2 结果与分析 | 第64-69页 |
| ·NPY-Y1在下丘脑、垂体、卵巢的分布定位 | 第64-65页 |
| ·下丘脑内NPY-Y1 mRNA原位杂交定位 | 第64页 |
| ·垂体内NPY-Y1 mRNA原位杂交定位 | 第64-65页 |
| ·卵巢内NPY-Y1 mRNA原位杂交定位 | 第65页 |
| ·GPR54在下丘脑、垂体、卵巢的分布定位 | 第65-67页 |
| ·下丘脑内GPR54 mRNA原位杂交定位 | 第65-66页 |
| ·垂体内GPR54 mRNA原位杂交定位 | 第66-67页 |
| ·卵巢内GPR54 mRNA原位杂交定位 | 第67页 |
| ·Ob-Rb在下丘脑、垂体、卵巢的分布定位 | 第67-69页 |
| ·下丘脑内Ob-Rb的免疫组化定位 | 第67-68页 |
| ·垂体内Ob-Rb的免疫组化定位 | 第68页 |
| ·卵巢内Ob-Rb的免疫组化定位 | 第68-69页 |
| 3 讨论 | 第69-73页 |
| ·下丘脑-垂体-卵巢轴调控 | 第69-70页 |
| ·初情期前后NPY-Y1 mRNA在下丘脑-垂体-卵巢轴内的定位 | 第70页 |
| ·初情期前后GPR54 mRNA在下丘脑-垂体-卵巢轴内的定位 | 第70-71页 |
| ·初情期前后Ob-Rb在下丘脑-垂体-卵巢轴内的定位 | 第71-73页 |
| 第四章 猪NPY-Y1、GPR54、OB-Rb在下丘脑-垂体-卵巢内的发育性变化研究 | 第73-90页 |
| 1 材料与方法 | 第73-78页 |
| ·实验材料 | 第73-74页 |
| ·实验动物 | 第73页 |
| ·质粒、菌株 | 第73页 |
| ·主要试剂 | 第73-74页 |
| ·主要仪器 | 第74页 |
| ·实验方法 | 第74-78页 |
| ·样品的采集 | 第74页 |
| ·RT-PCR应用的引物序列 | 第74-76页 |
| ·RNA的提取与检测 | 第76页 |
| ·cDNA的合成 | 第76页 |
| ·实时荧光定量标准品的克隆 | 第76页 |
| ·荧光定量标准曲线的制备 | 第76-77页 |
| ·样品中β-actin、猪NPY-Y1、GPR54与Ob-Rb基因的检测 | 第77页 |
| ·统计分析 | 第77-78页 |
| 2 结果与分析 | 第78-85页 |
| ·RNA鉴定 | 第78页 |
| ·基因扩增与克隆测序 | 第78页 |
| ·QRT-PCR结果 | 第78-80页 |
| ·下丘脑、垂体与卵巢内NPY-Y1 mRNA表达实时荧光定量检测 | 第80-82页 |
| ·下丘脑、垂体与卵巢内GPR54 mRNA表达实时荧光定量检测 | 第82-83页 |
| ·下丘脑、垂体与卵巢内Ob-Rb mRNA表达实时荧光定量检测 | 第83-85页 |
| 3 讨论 | 第85-90页 |
| ·荧光定量PCR技术 | 第85页 |
| ·动物初情期的启动 | 第85-86页 |
| ·下丘脑-垂体-卵巢内NPY-Y1 mRNA的发育性变化 | 第86页 |
| ·下丘脑-垂体-卵巢内GPR54 mRNA的发育性变化 | 第86-87页 |
| ·下丘脑-垂体-卵巢内Ob-Rb mRNA的发育性变化 | 第87-88页 |
| ·NPY-Y1、GPR54、Ob-Rb基因的表达的相关性 | 第88-90页 |
| ·NPY与GnRH脉冲释放 | 第88页 |
| ·leptin与GnRH脉冲释放 | 第88-90页 |
| 第五章 应用差异显示技术对猪初情期启动关键因子的研究 | 第90-111页 |
| 1 材料与方法 | 第90-96页 |
| ·实验动物 | 第90页 |
| ·主要试剂 | 第90页 |
| ·主要引物 | 第90-92页 |
| ·组织总RNA的提取 | 第92页 |
| ·反转录——cDNA第一链的获得 | 第92页 |
| ·DDRT-PCR | 第92页 |
| ·琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第92-93页 |
| ·1%琼脂糖凝胶电泳 | 第92页 |
| ·10%聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第92-93页 |
| ·凝胶的银染处理 | 第93页 |
| ·差异片段的回收及二次PCR | 第93-94页 |
| ·差异片段的回收—煮沸法 | 第93页 |
| ·二次PCR | 第93-94页 |
| ·二次PCR产物的克隆 | 第94页 |
| ·Reverse Northern杂交法剔除猪下丘脑内ESTs的假阳性 | 第94页 |
| ·半定量法检测ESTs在不同发育时期猪下丘脑内的表达 | 第94-96页 |
| 2 结果与分析 | 第96-104页 |
| ·总RNA样品制备的结果 | 第96页 |
| ·DDRT-PCR结果 | 第96-97页 |
| ·差异片段回收及二次PCR | 第97-98页 |
| ·Reverse Northern杂交剔除假阳性干扰 | 第98-99页 |
| ·差异片段测序及比对 | 第99-104页 |
| ·半定量RT-PCR检测差异条带的表达 | 第104页 |
| 3 讨论 | 第104-111页 |
| ·反应所用引物的筛选 | 第104-105页 |
| ·反应条件对试验结果的影响 | 第105页 |
| ·不同差异条带回收的方法对获得差异表达ESTs的量的变化 | 第105页 |
| ·采用改进后的差异显示技术对本实验结果的影响 | 第105-106页 |
| ·采用半定量技术对本实验结果的影响 | 第106-107页 |
| ·差异序列的生物信息学分析 | 第107-111页 |
| ·MS01功能预测 | 第107-109页 |
| ·TLR在中枢神经系统的表达 | 第107-108页 |
| ·Toll介导的信号转导 | 第108-109页 |
| ·MS02功能预测 | 第109页 |
| ·MS03功能预测 | 第109-110页 |
| ·MS04、MS05、MS06功能预测 | 第110-111页 |
| 全文结论 | 第111-113页 |
| 参考文献 | 第113-124页 |
| 致谢 | 第124-126页 |
