| 中文摘要 | 第1-13页 |
| Abstract | 第13-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-32页 |
| 引言 | 第15-16页 |
| 1 蛋白酶的研究进展 | 第16-28页 |
| ·蛋白酶的分类与命名 | 第16-19页 |
| ·丝氨酸蛋白酶 | 第17-18页 |
| ·天冬氨酸蛋白酶 | 第18页 |
| ·半胱氨酸蛋白酶 | 第18页 |
| ·金属蛋白酶 | 第18-19页 |
| ·未知类型蛋白酶 | 第19页 |
| ·蛋白酶的来源 | 第19-20页 |
| ·细菌蛋白酶 | 第19-20页 |
| ·真菌蛋白酶 | 第20页 |
| ·病毒蛋白酶 | 第20页 |
| ·蛋白酶的功能及应用 | 第20-23页 |
| ·蛋白酶的生物学功能 | 第20-21页 |
| ·蛋白酶的应用 | 第21-23页 |
| ·微生物蛋白酶的基因工程 | 第23-26页 |
| ·蛋白质工程 | 第26-28页 |
| 2 高温蛋白酶及其来源 | 第28-30页 |
| ·嗜热微生物和高温酶 | 第28-29页 |
| ·高温蛋白酶 | 第29-30页 |
| 3 选题的目的意义、研究内容、技术路线 | 第30-32页 |
| ·选题的目的意义 | 第30-31页 |
| ·研究内容 | 第31页 |
| ·技术路线 | 第31-32页 |
| 第二章 嗜热子囊菌光孢变种热稳定蛋白酶基因的克 隆及其序列分析 | 第32-69页 |
| 1 材料和方法 | 第32-47页 |
| ·研究材料 | 第32-34页 |
| ·基因来源菌 | 第32页 |
| ·菌株和质粒 | 第32-33页 |
| ·主要生化和分子生物学试剂、酶 | 第33页 |
| ·仪器 | 第33-34页 |
| ·培养基 | 第34页 |
| ·溶液配制 | 第34页 |
| ·嗜热子囊菌光孢变种热稳定蛋白酶cDNA 基因的克隆 | 第34-43页 |
| ·引物设计 | 第34-37页 |
| ·总RNA 的提取（Trizol 法） | 第37页 |
| ·紫外检测RNA 产率和纯度 | 第37页 |
| ·反转录cDNA 第一链的合成 | 第37-38页 |
| ·目的基因cDNA 中间片段Ⅰ的分离 | 第38-42页 |
| ·中间片段Ⅱ的分离 | 第42页 |
| ·目的基因3’末端的分离（3’-RACE） | 第42-43页 |
| ·目的基因DNA 序列和全长cDNA 的克隆 | 第43-47页 |
| ·引物设计 | 第43页 |
| ·基因组DNA 的抽提 | 第43-44页 |
| ·蛋白酶基因DNA 序列中间片段的PCR 扩增 | 第44页 |
| ·蛋白酶基因DNA 序列5’端序列的TAIL-PCR 扩增 | 第44-46页 |
| ·蛋白酶基因DNA 与全长cDNA 序列的克隆 | 第46-47页 |
| ·蛋白酶基因全长序列的生物信息学分析 | 第47页 |
| ·蛋白酶基因DNA 序列分析 | 第47页 |
| 2 结果与分析 | 第47-65页 |
| ·T. aurantiacus var. levisporus 蛋白酶基因扩增模板的提取 | 第47-49页 |
| ·T. aurantiacus var. levisporus 总RNA 的提取 | 第47-48页 |
| ·T. aurantiacus var. levisporus Genomic DNA 的提取 | 第48-49页 |
| ·T. aurantiacus var. levisporus 蛋白酶基因cDNA 与DNA 序列的扩增 | 第49-54页 |
| ·T. aurantiacus var. levisporus 蛋白酶基因中间片段Ⅰ的分离 | 第49-50页 |
| ·T. aurantiacus var. levisporus 蛋白酶基因中间片段Ⅱ的分离 | 第50页 |
| ·T. aurantiacus var. levisporus 蛋白酶基因3’-末端cDNA 的分离 | 第50-51页 |
| ·T. aurantiacus var. levisporus 蛋白酶基因cDNA 5’-末端的分离 | 第51-52页 |
| ·T. aurantiacus var. levisporus 蛋白酶基因全长cDNA 的分离及扩增片断的序列拼接 | 第52-53页 |
| ·T. aurantiacus var. levisporus 蛋白酶全长DNA 的扩增 | 第53-54页 |
| ·蛋白酶基因Tapro 的核苷酸序列和氨基酸序列分析 | 第54-65页 |
| ·蛋白酶基因Tapro 的核苷酸序列分析 | 第57页 |
| ·蛋白酶基因Tapro 的氨基酸序列分析 | 第57页 |
| ·蛋白酶基因Tapro 的结构域分析 | 第57-58页 |
| ·蛋白酶转运分析 | 第58-60页 |
| ·蛋白酶基因Tapro 的氨基酸组成 | 第60-61页 |
| ·蛋白酶基因Tapro 结构及加工后的修饰分析 | 第61-65页 |
| 3 讨论 | 第65-69页 |
| ·研究方法 | 第65-66页 |
| ·蛋白酶基因Tapro 的结构 | 第66-69页 |
| 第三章 嗜热子囊菌光孢变种热稳定蛋白酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第69-100页 |
| 1 材料和方法 | 第69-85页 |
| ·材料 | 第69-74页 |
| ·基因来源菌 | 第69页 |
| ·菌株和质粒 | 第69-70页 |
| ·酶和生化试剂 | 第70-72页 |
| ·培养基及有关溶液的配制 | 第72-73页 |
| ·主要仪器设备 | 第73-74页 |
| ·试验方法 | 第74-85页 |
| ·蛋白酶Tapro 基因序列的分离 | 第74-76页 |
| ·蛋白酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第76-85页 |
| 2 结果与分析 | 第85-97页 |
| ·蛋白酶Tapro 表达基因序列的限制性酶切位点分析结果 | 第85-86页 |
| ·蛋白酶Tapro 编码序列的分离 | 第86-87页 |
| ·蛋白酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第87-97页 |
| ·酵母表达载体的构建和鉴定 | 第87-90页 |
| ·重组酵母表达质粒pPIC9K/Tapro 转化 P. pastoris GS115 及酵母转化子的筛选 | 第90-94页 |
| ·蛋白酶基因Tapro 在P. pastoris 中的高效表达及表达产物的检测 | 第94-97页 |
| 3 讨论 | 第97-100页 |
| ·表达系统的选择 | 第97页 |
| ·表达载体构建 | 第97-98页 |
| ·线性化的原因及不同线性化方式的影响 | 第98页 |
| ·影响毕赤酵母高效表达的原因 | 第98-99页 |
| ·蛋白的翻译及加工 | 第99-100页 |
| 第四章 酵母工程菌株分泌表达蛋白酶的纯化及其性质研究 | 第100-113页 |
| 1 材料和方法 | 第100-104页 |
| ·实验材料 | 第100-101页 |
| ·蛋白酶工程菌株 | 第100页 |
| ·主要试剂 | 第100页 |
| ·培养基 | 第100页 |
| ·主要仪器设备 | 第100-101页 |
| ·实验方法 | 第101-104页 |
| ·巴斯德毕赤酵母分泌表达产物的纯化 | 第101-102页 |
| ·蛋白质分子量测定和纯度鉴定 | 第102页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第102-103页 |
| ·表达蛋白酶酶学特性的研究 | 第103-104页 |
| 2 结果与分析 | 第104-111页 |
| ·重组蛋白酶的纯化 | 第104-106页 |
| ·DEAE-Sepharose 阴离子交换柱层析 | 第104-105页 |
| ·蛋白酶分子量和纯度鉴定 | 第105-106页 |
| ·表达蛋白酶的特性研究 | 第106-111页 |
| ·表达蛋白酶的最适反应温度 | 第106页 |
| ·表达蛋白酶的最适反应pH 值 | 第106-107页 |
| ·表达蛋白酶的热稳定性 | 第107-108页 |
| ·表达蛋白酶的pH 值稳定性 | 第108页 |
| ·金属离子对表达蛋白酶活性的影响 | 第108-109页 |
| ·不同浓度蛋白酶抑制剂对表达蛋白酶活性的影响 | 第109页 |
| ·变性剂对蛋白酶活性的影响 | 第109-110页 |
| ·表达蛋白酶对不同底物活性的测定 | 第110-111页 |
| 3 讨论 | 第111-113页 |
| ·蛋白酶的纯化 | 第111页 |
| ·蛋白酶的稳定性 | 第111-112页 |
| ·蛋白酶分类验证 | 第112-113页 |
| 结论和建议 | 第113-115页 |
| 1. 结论 | 第113页 |
| 2. 建议 | 第113-115页 |
| 参考文献 | 第115-128页 |
| 致谢 | 第128页 |
