| 摘要 | 第7-9页 |
| ABSTRACT | 第9-10页 |
| 主要符号对照表 | 第16-17页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-35页 |
| 1.1 CRISPR/Cas技术 | 第17-19页 |
| 1.1.1 CRISPR/Cas简介 | 第17页 |
| 1.1.2 CRISPR/Cas系统的结构与类型 | 第17-18页 |
| 1.1.3 CRISPR/Cas9 技术的开发与应用 | 第18-19页 |
| 1.2 DNA双链断裂的修复机制 | 第19-21页 |
| 1.2.1 NHEJ介导的双链断裂修复 | 第19-20页 |
| 1.2.2 HDR介导的双链断裂修复 | 第20-21页 |
| 1.3 HDR介导的精准编辑 | 第21-25页 |
| 1.3.1 选择合适的核酸酶 | 第22-23页 |
| 1.3.2 优化gRNA的设计 | 第23页 |
| 1.3.3 同源修复模板的设计 | 第23-25页 |
| 1.4 提高HDR精准编辑效率的策略 | 第25-27页 |
| 1.4.1 抑制NHEJ通路或者激活HDR通路 | 第25-26页 |
| 1.4.2 控制细胞周期 | 第26页 |
| 1.4.3 其它提高HDR效率的策略 | 第26-27页 |
| 1.5 筛选富集基因编辑细胞的策略 | 第27-30页 |
| 1.5.1 筛选转染阳性的细胞 | 第27-28页 |
| 1.5.2 筛选核酸酶活性的细胞 | 第28-29页 |
| 1.5.3 利用内源性基因为标记进行筛选 | 第29-30页 |
| 1.6 筛选富集HDR修复细胞的策略 | 第30-31页 |
| 1.7 基因组精准编辑在畜牧业中的应用 | 第31-33页 |
| 1.7.1 精准编辑在猪中的应用 | 第31-32页 |
| 1.7.2 精准编辑在牛中的应用 | 第32-33页 |
| 1.7.3 精准编辑在羊中的应用 | 第33页 |
| 1.8 本研究的目的意义 | 第33-35页 |
| 第二章 CRISPR/Cas9 介导HDR修复细胞的通用筛选报告载体系统的构建 | 第35-48页 |
| 2.1 试验材料 | 第35-36页 |
| 2.1.1 试验菌种、质粒及细胞系 | 第35页 |
| 2.1.2 主要试剂及仪器 | 第35-36页 |
| 2.1.3 引物 | 第36页 |
| 2.2 试验方法 | 第36-42页 |
| 2.2.1 筛选报告载体HDR-USR1 的构建 | 第36-40页 |
| 2.2.2 筛选报告载体HDR-USR2 的构建 | 第40页 |
| 2.2.3 筛选载体pPuro-T2A-eGFP的构建 | 第40-41页 |
| 2.2.4 细胞培养、转染与药物筛选 | 第41-42页 |
| 2.3 试验结果 | 第42-46页 |
| 2.3.1 筛选报告载体HDR-USR1 的鉴定 | 第42-44页 |
| 2.3.2 筛选报告载体HDR-USR2 的鉴定 | 第44页 |
| 2.3.3 筛选载体pPuro-T2A-eGFP的鉴定 | 第44页 |
| 2.3.4 验证三种筛选报告载体是否工作 | 第44-46页 |
| 2.4 讨论 | 第46-47页 |
| 2.5 小结 | 第47-48页 |
| 第三章 HDR-USR在富集HDR介导精准点编辑细胞中的应用 | 第48-73页 |
| 3.1 试验材料 | 第49-50页 |
| 3.1.1 质粒和细胞 | 第49页 |
| 3.1.2 主要试剂和仪器 | 第49页 |
| 3.1.3 引物 | 第49-50页 |
| 3.2 试验方法 | 第50-58页 |
| 3.2.1 不同基因位点打靶载体的构建 | 第50-51页 |
| 3.2.2 不同基因位点供体载体的构建 | 第51-53页 |
| 3.2.3 不同基因位点SSA-RPG和 NHEJ-RPG载体的构建 | 第53-54页 |
| 3.2.4 细胞培养 | 第54-55页 |
| 3.2.5 细胞转染 | 第55页 |
| 3.2.6 嘌呤霉素筛选浓度的确定 | 第55页 |
| 3.2.7 比较不同筛选报告载体富集细胞后的细胞存活状态以及HDR效率 | 第55-56页 |
| 3.2.8 验证HDR-USR是否能应用于多种细胞的不同基因位点 | 第56页 |
| 3.2.9 扩增子深度测序进一步分析HDR和 NHEJ效率 | 第56页 |
| 3.2.10 验证HDR-USR在同时富集两个基因位点精准点编辑细胞中的应用 | 第56页 |
| 3.2.11 HDR-USR富集细胞后挑取细胞单克隆进行基因分型 | 第56-57页 |
| 3.2.12 HDR-USR富集细胞中随机整合以及脱靶效应检测 | 第57-58页 |
| 3.3 试验结果 | 第58-71页 |
| 3.3.1 不同基因位点打靶载体的鉴定 | 第58页 |
| 3.3.2 不同基因位点供体载体的鉴定 | 第58-59页 |
| 3.3.3 不同基因位点SSA-RPG和 NHEJ-RPG载体的鉴定 | 第59-60页 |
| 3.3.4 不同细胞系的细胞形态及其嘌呤霉素工作浓度的确定 | 第60-61页 |
| 3.3.5 不同报告载体组嘌呤霉素筛选后细胞存活情况 | 第61页 |
| 3.3.6 HEK293T细胞EMX1、AAVS1、CCR5、VEGF、HPRT1和NUDT5 位点利用不同报告载体富集后HDR效率的比较 | 第61-64页 |
| 3.3.7 HDR-USR系统在不同细胞系富集HDR修复细胞中的应用 | 第64-66页 |
| 3.3.8 EMX1 位点利用HDR-USR富集后细胞单克隆的基因分型 | 第66-67页 |
| 3.3.9 HDR-USR系统在同时富集EMX1和AAVS1 两个基因位点精准点编辑细胞中的应用 | 第67-69页 |
| 3.3.10 HDR-USR富集细胞中随机整合以及脱靶效应的检测 | 第69-71页 |
| 3.4 讨论 | 第71-72页 |
| 3.5 小结 | 第72-73页 |
| 第四章 HDR-USR在富集HDR介导的基因片段插入与片段删除细胞中的应用 | 第73-88页 |
| 4.1 试验材料 | 第74-75页 |
| 4.1.1 质粒和细胞 | 第74页 |
| 4.1.2 主要试剂和仪器 | 第74页 |
| 4.1.3 引物 | 第74-75页 |
| 4.2 试验方法 | 第75-79页 |
| 4.2.1 GAPDH位点基因片段插入相关的三个打靶载体以及GAPDH-SSA-RPG载体的构建 | 第75-76页 |
| 4.2.2 GAPDH位点eGFP插入相关供体载体的构建 | 第76-77页 |
| 4.2.3 GAPDH位点eGFP插入相关不同同源臂长度供体的制备 | 第77-78页 |
| 4.2.4 流式细胞仪分析三个GAPDH打靶载体的打靶效率 | 第78页 |
| 4.2.5 流式细胞仪分析HDR介导的eGFP插入效率 | 第78页 |
| 4.2.6 构建AAVS1 位点片段删除相关的两个打靶载体 | 第78页 |
| 4.2.7 构建AAVS1 位点片段删除相关的供体载体 | 第78-79页 |
| 4.2.8 细胞转染、挑细胞单克隆及基因分型鉴定 | 第79页 |
| 4.3 试验结果 | 第79-86页 |
| 4.3.1 GAPDH位点片段插入相关打靶载体及GAPDH-SSA-RPG载体的鉴定 | 第79-80页 |
| 4.3.2 GAPDH位点eGFP插入供体载体pD-eGFP-KI的鉴定 | 第80-81页 |
| 4.3.3 GAPDH位点片段插入相关三个sgRNAs打靶效率的比较 | 第81-82页 |
| 4.3.4 未筛组与HDR-USR筛选组中HDR介导的e GFP整合效率的比较 | 第82-84页 |
| 4.3.5 AAVS1 位点片段删除相关的打靶载体以及供体载体的鉴定 | 第84页 |
| 4.3.6 未筛组与HDR-USR筛选组中HDR介导的AAVS1 删除效率的比较 | 第84-86页 |
| 4.4 讨论 | 第86-87页 |
| 4.5 小结 | 第87-88页 |
| 第五章 HDR-USR系统的优化 | 第88-103页 |
| 5.1 试验材料 | 第88-90页 |
| 5.1.1 质粒和细胞 | 第88页 |
| 5.1.2 主要试剂和仪器 | 第88页 |
| 5.1.3 ssODNs | 第88页 |
| 5.1.4 引物 | 第88-90页 |
| 5.2 试验方法 | 第90-94页 |
| 5.2.1 含有不同打靶效率靶位点(sgT1、sgT2、sgT3)的三个HDR-USR载体的构建 | 第90-91页 |
| 5.2.2 含有不同靶位点的四个HDR-USR载体富集HDR效率的比较 | 第91页 |
| 5.2.3 嘌呤霉素药物筛选时间对HDR-USR富集HDR效率的影响 | 第91页 |
| 5.2.4 Ad4E1B-E4orf6、yRad52、SCR7和nocodazole对 HDR-USR富集HDR效率的影响 | 第91-93页 |
| 5.2.5 不同类型的供体对HDR-USR富集HDR效率的影响 | 第93-94页 |
| 5.3 试验结果 | 第94-100页 |
| 5.3.1 HDR-USR四个靶位点打靶活性的比较 | 第94-95页 |
| 5.3.2 含有不同靶位点的四个HDR-USR在 EMX1、AAVS1、HPRT1 三个位点富集HDR效率的比较 | 第95-96页 |
| 5.3.3 嘌呤霉素药物筛选时间对HDR-USR富集HDR效率的影响 | 第96-97页 |
| 5.3.4 Ad4E1B-E4orf6、yRad52、SCR7和nocodazole对 HDR-USR富集HDR效率的影响 | 第97-98页 |
| 5.3.5 不同类型供体对HDR-USR富集HDR效率的影响 | 第98-100页 |
| 5.4 讨论 | 第100-101页 |
| 5.5 小结 | 第101-103页 |
| 结论与创新点 | 第103-104页 |
| 参考文献 | 第104-112页 |
| 致谢 | 第112-113页 |
| 作者简介 | 第113-114页 |
