| 学位论文数据集 | 第3-4页 |
| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 符号说明 | 第21-22页 |
| 第一章 绪论 | 第22-38页 |
| 1.1 活性氧簇(Reactive Oxygen Species, ROS) | 第22页 |
| 1.2 ROS检测的重要意义 | 第22-23页 |
| 1.3 ROS的检测手段 | 第23-30页 |
| 1.3.1 roGFP(Reduction-oxidation-sensitive Green Fluorescent Protein)家族 | 第23-25页 |
| 1.3.2 rxYFP家族 | 第25-26页 |
| 1.3.3 Redoxfluor (Genetically Encoded Fluorescence Resonance Energy TransferProbe) | 第26-27页 |
| 1.3.4 cpYFP | 第27-28页 |
| 1.3.5 Hyper系列内源性细胞传感器 | 第28-29页 |
| 1.3.6 Redox特异敏感型的量子点探针 | 第29-30页 |
| 1.3.7 常见的外源性ROS检测探针 | 第30页 |
| 1.4 基因编码内源性细胞传感器的应用以及优势 | 第30-31页 |
| 1.5 293T细胞中ROS检测的重要意义 | 第31页 |
| 1.6 ROS是白血病检测的细胞水平标志物 | 第31-32页 |
| 1.7 Keap1/Nrf2-ARE信号通路 | 第32-35页 |
| 1.7.1 Keap1蛋白质(Epoxy Chloropropane Kelch Sample related Protein-1, Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1) | 第32-33页 |
| 1.7.2 Nrf2(Nuclear Factor Erythroid-2 related Factor 2,核因子E2相关因子2) | 第33-34页 |
| 1.7.3 ARE(Antioxidant Response Element,抗氧化反应元件) | 第34页 |
| 1.7.4 Keap1/Nrf2-ARE信号通路的反应机制 | 第34-35页 |
| 1.8 课题研究内容以及选题意义 | 第35-38页 |
| 1.8.1 课题主要研究内容 | 第35-36页 |
| 1.8.2 研究成果及创新点 | 第36-38页 |
| 1.8.2.1 主要研究成果 | 第36页 |
| 1.8.2.2 创新点 | 第36-38页 |
| 第二章 基于Keap1/NRF2-ARE信号通路的内源性基因编码ROS细胞传感器的构建 | 第38-70页 |
| 2.1 引言 | 第38页 |
| 2.2 内源性基因编码ROS细胞传感器的设计 | 第38-41页 |
| 2.3 实验材料及仪器 | 第41-43页 |
| 2.3.1 实验试剂与材料 | 第41-42页 |
| 2.3.2 实验仪器与设备 | 第42-43页 |
| 2.4 元件序列 | 第43-46页 |
| 2.5 实验方法 | 第46-68页 |
| 2.5.1 pLVX-5XARE-hCMVmp-mCherry-Puro质粒构建 | 第46-52页 |
| 2.5.1.1 Oligo退火合成制备5XARE和hCMVmp片段 | 第46-47页 |
| 2.5.1.2 pLVX-mCherry-T2A-Puro载体骨架制备 | 第47-49页 |
| 2.5.1.3 目标片段与载体骨架连接构建重组质粒 | 第49-50页 |
| 2.5.1.4 转化 | 第50页 |
| 2.5.1.5 挑选单克隆菌落并且进行PCR验证以及测序 | 第50-52页 |
| 2.5.2 pLVX-Keap1-T2A-EGFP-T2A-Nrf2-Puro质粒构建 | 第52-65页 |
| 2.5.2.1 Hela细胞(人源)的总RNA提取 | 第52-53页 |
| 2.5.2.2 基因组DNA的去除和cDNA的合成 | 第53-54页 |
| 2.5.2.3 设计引物并且从cDNA模板上运用PCR手段获取Keap1和Nrf2基因片段 | 第54-56页 |
| 2.5.2.4 EGFP片段的获取 | 第56-58页 |
| 2.5.2.5 pLVX-T2A-EGFP-Puro质粒构建 | 第58-60页 |
| 2.5.2.6 pLVX-Keap1-T2A-EGFP-Puro质粒构建 | 第60-63页 |
| 2.5.2.7 pLVX-Keap1-T2A-EGFP-T2A-Nrf2-Puro质粒构建 | 第63-65页 |
| 2.5.3 pLVX-5XARE-hCMVmp-mNeonGreen-Puro质粒构建 | 第65-66页 |
| 2.5.3.1 含mNeonGreen基因的大肠杆菌复苏 | 第65页 |
| 2.5.3.2 mNeonGreen的PCR引物设计 | 第65页 |
| 2.5.3.3 mNeonGreen基因片段PCR | 第65-66页 |
| 2.5.3.4 mNeonGreen基因片段Cycle-Puro | 第66页 |
| 2.5.3.5 mNeonGreen基因片段和pLVX-5XARE-hCMVmp-mCherry-Puro载体的酶切 | 第66页 |
| 2.5.3.6 胶回收、连接、转化、测序和提取去内毒素质粒 | 第66页 |
| 2.5.4 pLVX-Keap1-T2A- mCherry-T2A-Nrf2-Puro质粒构建 | 第66-68页 |
| 2.5.4.1 mCherry基因的PCR引物设计 | 第67页 |
| 2.5.4.2 mCherry基因片段PCR | 第67页 |
| 2.5.4.3 mCherry基因片段Cycle-Puro | 第67-68页 |
| 2.5.4.4 mCherry基因片段和pLVX-Keap1-T2A-EGFP-T2A-Nrf2-Puro载体的酶切 | 第68页 |
| 2.5.4.5 胶回收、连接、转化、测序和提取去内毒素质粒 | 第68页 |
| 2.5.5 潮霉素(HygR)替代嘌呤霉素(Puro) | 第68页 |
| 2.5.5.1 HygR基因片段的PCR引物设计 | 第68页 |
| 2.5.5.2 HygR的片段PCR | 第68页 |
| 2.5.5.3 HygR基因片段进行Cycle-Puro回收 | 第68页 |
| 2.5.5.4 胶回收、连接、转化、测序和提取去内毒素质粒 | 第68页 |
| 2.6 实验结果与讨论 | 第68-69页 |
| 2.6.1 基因片段和载体骨架的电泳结果 | 第68-69页 |
| 2.6.2 载体检测电泳结果 | 第69页 |
| 2.6.3 质粒构建成功 | 第69页 |
| 2.7 本章小结 | 第69-70页 |
| 第三章 基于Keap1/Nrf2-ARE信号通路的内源性基因编码ROS细胞传感器初步评估 | 第70-98页 |
| 3.1 引言 | 第70页 |
| 3.2 实验材料与仪器 | 第70-71页 |
| 3.2.1 实验试剂与材料 | 第70-71页 |
| 3.2.2 实验仪器与设备 | 第71页 |
| 3.3 实验方法 | 第71-74页 |
| 3.3.1 293T细胞的培养方法 | 第71页 |
| 3.3.2 H_2O_2外源刺激瞬时转染实验设计 | 第71-72页 |
| 3.3.3 Poly-fector试剂瞬时转染实验 | 第72-73页 |
| 3.3.4 lipo3000转染试剂瞬时转染实验 | 第73-74页 |
| 3.3.5 H_2O_2外源刺激实验 | 第74页 |
| 3.3.6 Cytation活细胞成像实验 | 第74页 |
| 3.3.7 流式细胞仪统计实验 | 第74页 |
| 3.4 实验结果与讨论 | 第74-95页 |
| 3.4.1 50 μM H_2O_2处理实验组以及对照组1实验现象和推论 | 第75-79页 |
| 3.4.2 100 μM H_2O_2处理实验组以及对照组1实验结果和推论 | 第79-82页 |
| 3.4.3 500μM H_2O_2处理实验组以及对照组1实验现象和推论 | 第82-86页 |
| 3.4.4 1 mM H_2O_2处理实验组以及对照组1 | 第86-90页 |
| 3.4.5 对照组2实验现象和推论 | 第90-92页 |
| 3.4.6 对照组3实验现象和推论 | 第92-93页 |
| 3.4.7 对照组4实验现象和推论 | 第93-95页 |
| 3.4.8 流式细胞仪统计结果 | 第95页 |
| 3.5 本章小结 | 第95-98页 |
| 第四章 基于Keap1/Nrf2-ARE通路的内源性基因编码ROS细胞传感器稳转细胞系的构建、筛选和检测 | 第98-134页 |
| 4.1 引言 | 第98-99页 |
| 4.2 实验材料和仪器 | 第99-100页 |
| 4.2.1 实验试剂和材料 | 第99-100页 |
| 4.2.2 实验仪器与设备 | 第100页 |
| 4.3 实验方法 | 第100-103页 |
| 4.3.1 铺293T细胞的细胞培养板 | 第100页 |
| 4.3.2 提取慢病毒包装质粒 | 第100页 |
| 4.3.3 病毒包装 | 第100-101页 |
| 4.3.4 病毒收集 | 第101页 |
| 4.3.5 病毒浓缩 | 第101页 |
| 4.3.6 病毒侵染 | 第101-102页 |
| 4.3.7 细胞冻存和复苏 | 第102-103页 |
| 4.3.8 H_2O_2评估稳转细胞系实验 | 第103页 |
| 4.3.9 紫杉醇(Paclitaxel,Px)药物刺激实验 | 第103页 |
| 4.3.10 白藜芦醇(Resveratrol,RV)药物刺激实验 | 第103页 |
| 4.4 实验结果与讨论 | 第103-132页 |
| 4.4.1 病毒包装检测 | 第104-105页 |
| 4.4.2 稳转细胞系获得 | 第105-106页 |
| 4.4.2.1 内源性基因编码ROS细胞传感器① | 第105-106页 |
| 4.2.2.2 内源性基因编码ROS细胞传感器② | 第106页 |
| 4.4.3 H_2O_2评估稳转细胞系实验检测 | 第106-114页 |
| 4.4.3.1 活细胞成像实验 | 第106-108页 |
| 4.4.3.2 ROS细胞传感器①流式细胞仪实验 | 第108-110页 |
| 4.4.3.3 ROS细胞传感器②流式细胞仪实验 | 第110-114页 |
| 4.4.4 紫杉醇(Paclitaxel)药物刺激实验 | 第114-122页 |
| 4.4.4.1 紫杉醇实验浓度确定 | 第114-115页 |
| 4.4.4.2 细胞传感器①紫杉醇药物刺激实验 | 第115-118页 |
| 4.4.4.3 细胞传感器②紫杉醇药物刺激实验 | 第118-122页 |
| 4.4.5 白藜芦醇(Resveratrol,RV)药物刺激实验检测 | 第122-132页 |
| 4.4.5.1 白藜芦醇实验浓度确定 | 第122页 |
| 4.4.5.2 细胞传感器①白藜芦醇药物刺激实验 | 第122-126页 |
| 4.4.5.3 细胞传感器②白藜芦醇药物刺激实验 | 第126-132页 |
| 4.5 本章小结 | 第132-134页 |
| 第五章 基于Keap1/Nrf2-ARE信号通路的内源性ROS细胞传感器在白血病细胞中的应用 | 第134-140页 |
| 5.1 引言 | 第134页 |
| 5.2 实验材料及仪器 | 第134-135页 |
| 5.2.1 实验试剂与材料 | 第134页 |
| 5.2.2 实验仪器与设备 | 第134-135页 |
| 5.3 实验方法 | 第135页 |
| 5.3.1 HL-60细胞瞬时转染实验 | 第135页 |
| 5.3.2 HL-60细胞病毒侵染实验 | 第135页 |
| 5.3.3 H_2O_2刺激实验 | 第135页 |
| 5.4 实验结果与讨论 | 第135-138页 |
| 5.4.1 500μM H_2O_2外源刺激实验结果 | 第136-137页 |
| 5.4.2 1.0 mM H_2O_2外源刺激实验结果 | 第137-138页 |
| 5.5 本章小结 | 第138-140页 |
| 第六章 结论与展望 | 第140-142页 |
| 参考文献 | 第142-146页 |
| 致谢 | 第146-148页 |
| 研究成果及发表的学术论文 | 第148-150页 |
| 作者与导师简介 | 第150-152页 |
| 附件 | 第152-153页 |
