| 中文摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 引言 | 第10-29页 |
| 1.1 常见的丝状真菌及其应用 | 第11-12页 |
| 1.1.1 黑曲霉(Apergllius niger) | 第11页 |
| 1.1.2 米曲霉(Aspergillus oryzae) | 第11-12页 |
| 1.1.3 构巢曲霉(Aspergillus nidulans) | 第12页 |
| 1.1.4 青霉属(Penicillium) | 第12页 |
| 1.1.5 红曲霉(Monascus purpureus Went.) | 第12页 |
| 1.2 转化方法 | 第12-18页 |
| 1.2.1 原生质体转化(protoplast-mediated transformation,PMT) | 第12-14页 |
| 1.2.1.1 原生质体转化基本步骤 | 第13-14页 |
| 1.2.1.2 原生质体转化方法的评价 | 第14页 |
| 1.2.2 电击转化(Electroporation) | 第14-16页 |
| 1.2.2.1 影响电击转化的因素 | 第15-16页 |
| 1.2.2.2 电击转化方法的评价 | 第16页 |
| 1.2.3 农杆菌介导转化(Agrobacterium-Mediated Transformation,AMT) | 第16-18页 |
| 1.2.3.1 影响农杆菌介导转化的因素 | 第17-18页 |
| 1.2.3.2 农杆菌介导转化方法的评价 | 第18页 |
| 1.2.4 基因枪法(Biolistic) | 第18页 |
| 1.3 筛选标签 | 第18-20页 |
| 1.3.1 药物抗性筛选标签 | 第19页 |
| 1.3.2 营养缺陷型筛选标签 | 第19页 |
| 1.3.3 报告基因 | 第19-20页 |
| 1.3.3.1 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP) | 第20页 |
| 1.3.3.2 荧光素酶 | 第20页 |
| 1.4 CRISPR/Cas系统 | 第20-26页 |
| 1.4.1 基因编辑技术的发展 | 第20-21页 |
| 1.4.2 CRISPR系统组分及作用机制 | 第21-24页 |
| 1.4.2.1 CRISPR系统组分 | 第21-23页 |
| 1.4.2.2 CRISPR/Cas9系统作用机制 | 第23-24页 |
| 1.4.3 DSBs修复途径 | 第24-25页 |
| 1.4.4 CRISPR系统的优势 | 第25-26页 |
| 1.5 本研究的目的意义、内容及技术路线 | 第26-29页 |
| 1.5.1 研究的目的意义 | 第26-27页 |
| 1.5.2 研究内容 | 第27-28页 |
| 1.5.2.1 核酸内切酶质粒的设计与构建 | 第27页 |
| 1.5.2.2 构建丝状真菌转化系统 | 第27页 |
| 1.5.2.3 sgRNA的设计与合成 | 第27页 |
| 1.5.2.4 sgRNA的电击转化 | 第27页 |
| 1.5.2.5 阳性克隆筛选及验证 | 第27-28页 |
| 1.5.3 技术路线 | 第28-29页 |
| 第二章 CRISPR系统应用于黑曲霉基因组编辑 | 第29-52页 |
| 2.1 实验材料 | 第29-36页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第29-30页 |
| 2.1.2 主要药品与耗材 | 第30-31页 |
| 2.1.2.1 试剂 | 第30页 |
| 2.1.2.2 试剂盒 | 第30-31页 |
| 2.1.2.3 耗材 | 第31页 |
| 2.1.3 主要培养基与试剂配制 | 第31-35页 |
| 2.1.3.1 试剂的配制 | 第31-33页 |
| 2.1.3.2 抗生素的配制 | 第33-34页 |
| 2.1.3.3 培养基的配制 | 第34-35页 |
| 2.1.4 仪器设备 | 第35-36页 |
| 2.2 实验方法 | 第36-52页 |
| 2.2.1 pCAMBIA1302-hFnCpf1载体的构建 | 第36-43页 |
| 2.2.1.1 In-Fusion引物的设计 | 第36-37页 |
| 2.2.1.2 载体构建思路及克隆模拟 | 第37-39页 |
| 2.2.1.3 pCAMBIA1302和pcDNA3.1-hFnCpf1质粒的准备 | 第39页 |
| 2.2.1.4 pCAMBIA1302质粒的双酶切及胶回收 | 第39-40页 |
| 2.2.1.5 hFnCpf1目的基因的PCR | 第40-41页 |
| 2.2.1.6 hFnCpf1目的基因PCR产物纯化 | 第41页 |
| 2.2.1.7 hFnCpf1目的基因与pCAMBIA1302-Nco I-Eco91 I载体In-Fusion反应 | 第41-42页 |
| 2.2.1.8 In-Fusion连接产物的转化 | 第42页 |
| 2.2.1.9 pCAMBIA1302-hFnCpf1重组质粒的PCR验证 | 第42-43页 |
| 2.2.2 农杆菌介导的黑曲霉转化系统的建立 | 第43-47页 |
| 2.2.2.1 A.niger CBS513.88菌株潮霉素耐受试验及引物的设计 | 第43-44页 |
| 2.2.2.2 农杆菌GV3101的培养与感受态细胞的制备 | 第44页 |
| 2.2.2.3 pCAMBIA1302-hFnCpf1质粒冻融法转化农杆菌GV3101感受态 | 第44-45页 |
| 2.2.2.4 农杆菌GV3101-pCAMBIA1302-hFnCpf1单菌落PCR检测阳性克隆 | 第45页 |
| 2.2.2.5 重组农杆菌的活化和诱导培养 | 第45-46页 |
| 2.2.2.6 黑曲霉孢子的获取 | 第46页 |
| 2.2.2.7 农杆菌介导的黑曲霉转化体系的建立 | 第46页 |
| 2.2.2.8 A.niger CBS513.88-pCAMBIA1302-hFnCpf1转化子基因组的提取 | 第46-47页 |
| 2.2.2.9 A.niger CBS513.88-pCAMBIA1302-hFnCpf1转化子的PCR验证 | 第47页 |
| 2.2.3 sgRNA的设计与合成 | 第47-50页 |
| 2.2.3.1 sgRNA的设计 | 第48页 |
| 2.2.3.2 体外转录sgRNA | 第48-50页 |
| 2.2.4 CRISPR系统应用于黑曲霉的编辑及验证 | 第50-52页 |
| 2.2.4.1 突变检测引物的设计 | 第50页 |
| 2.2.4.2 A.niger CBS513.88-pCAMBIA1302-hFnCpf1孢子的收集 | 第50-51页 |
| 2.2.4.3 电击参数的设置、电击及筛选 | 第51页 |
| 2.2.4.4 突变单菌落的筛选 | 第51页 |
| 2.2.4.5 突变单菌落的PCR验证 | 第51页 |
| 2.2.4.6 突变单菌落的测序结果分析与讨论 | 第51-52页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第52-86页 |
| 3.1 pCAMBIA1302-hFnCpf1载体的构建结果 | 第52-53页 |
| 3.2 农杆菌介导的黑曲霉转化系统的构建 | 第53-66页 |
| 3.2.1 A.niger CBS 513.88与Agrobacterium tumefaciens GV3101的培养结果 | 第53-54页 |
| 3.2.2 A.niger CBS513.88的潮霉素耐受试验结果分析 | 第54-55页 |
| 3.2.3 pCAMBIA1302-hFnCpf1质粒转化农杆菌GV3101感受态的效率与鉴定 | 第55-57页 |
| 3.2.4 农杆菌介导的黑曲霉转化的效率与分析 | 第57-63页 |
| 3.2.4.1 黑曲霉孢子的获取情况 | 第57页 |
| 3.2.4.2 农杆菌介导的黑曲霉转化初步探究结果 | 第57-63页 |
| 3.2.5 A.niger CBS513.88-pCAMBIA1302-hFnCpf1转化子的二次筛选 | 第63-64页 |
| 3.2.6 A.niger CBS513.88-pCAMBIA1302-hFnCpf1转化子的验证结果分析 | 第64-66页 |
| 3.3 sgRNA的设计与合成 | 第66-69页 |
| 3.3.1 sgRNA的设计思路与结果 | 第66-68页 |
| 3.3.2 sgRNA的体外转录结果与分析 | 第68-69页 |
| 3.4 CRISPR系统应用于黑曲霉的基因组编辑及验证 | 第69-86页 |
| 3.4.1 电击后培养结果 | 第69-70页 |
| 3.4.2 突变子的筛选 | 第70-72页 |
| 3.4.3 突变子验证结果分析 | 第72-83页 |
| 3.4.3.1 目的基因PCR结果与分析 | 第72-74页 |
| 3.4.3.2 突变子的hph基因测序结果分析及核酸序列对位排列 | 第74-81页 |
| 3.4.3.3 突变子表达框架分析 | 第81-82页 |
| 3.4.3.4 构建起始菌株与突变子的核酸序列、蛋白序列的进化树 | 第82-83页 |
| 3.4.4 CRISPR/Cpf1系统应用于黑曲霉基因组编辑结果讨论及分析 | 第83-86页 |
| 3.4.4.1 影响编辑效率的因素 | 第83-84页 |
| 3.4.4.2 编辑的精确性分析 | 第84-86页 |
| 结论与展望 | 第86-88页 |
| 参考文献 | 第88-97页 |
| 致谢 | 第97-98页 |
| 个人简历、在学期间的研究成果及发布的学术论文 | 第98页 |
