| 摘要 | 第5-7页 |
| abstract | 第7-8页 |
| 1 文献综述 | 第11-20页 |
| 1.1 基因组编辑技术的概念及发展历史 | 第11-13页 |
| 1.1.1 基因编辑技术的概念 | 第11页 |
| 1.1.2 ZFN基因组编辑技术 | 第11-12页 |
| 1.1.3 TALEN基因组编辑技术 | 第12-13页 |
| 1.2 CRISPR/Cas9基因组编辑技术 | 第13-15页 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas9系统的结构及作用机理 | 第13-15页 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas9系统的优势与不足 | 第15页 |
| 1.3 CRISPR/Cas9 系统在丝状真菌基因组编辑中的研究进展 | 第15-17页 |
| 1.3.1 丝状真菌基因组编辑中的限制因素 | 第15-16页 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas9系统在丝状真菌基因组编辑中的应用 | 第16-17页 |
| 1.4 虫生真菌中 CRISPR/Cas9 基因组编辑系统的研究现状 | 第17-19页 |
| 1.5 研究的目的和意义 | 第19-20页 |
| 2 实验材料与方法 | 第20-31页 |
| 2.1 实验材料 | 第20-25页 |
| 2.1.1 供试菌株和载体 | 第20页 |
| 2.1.2 主要化学试剂与生物试剂 | 第20-21页 |
| 2.1.3 培养基配方及制作方法 | 第21-23页 |
| 2.1.4 主要试剂配方 | 第23-24页 |
| 2.1.5 实验仪器及设备 | 第24-25页 |
| 2.2 实验方法 | 第25-31页 |
| 2.2.1 菌株保藏方法 | 第25页 |
| 2.2.2 PCR扩增体系和条件 | 第25页 |
| 2.2.3 DNA片段回收 | 第25-26页 |
| 2.2.4 限制性内切酶酶切体系 | 第26页 |
| 2.2.5 T4DNALigase连接反应体系 | 第26页 |
| 2.2.6 AGL-1农杆菌介导转化法导入质粒 | 第26-28页 |
| 2.2.7 绿僵菌DNA的提取 | 第28页 |
| 2.2.8 绿僵菌RNA的提取 | 第28页 |
| 2.2.9 绿僵菌 Cas9 蛋白印记检测（Western Blot） | 第28-31页 |
| 3 实验结果 | 第31-42页 |
| 3.1 两步法构建罗伯茨绿僵菌CRISPR/Cas9基因组编辑系统 | 第31-37页 |
| 3.1.1 Cas9蛋白表达载体的构建 | 第31-34页 |
| 3.1.2 Cas9-bar质粒导入罗伯茨绿僵菌 | 第34页 |
| 3.1.3 Cas9序列表达验证 | 第34-35页 |
| 3.1.4 sgRNA表达载体的构建 | 第35-36页 |
| 3.1.5 sgRNA-ben质粒导入插入了Cas9序列的罗伯茨绿僵菌 | 第36页 |
| 3.1.6 阳性转化子与野生型的表型对照 | 第36-37页 |
| 3.2 一步法构建罗伯茨绿僵菌CRISPR/Cas9基因组编辑系统 | 第37-42页 |
| 3.2.1 Cas9-bar-gRNA-EGFP质粒的构建 | 第37-39页 |
| 3.2.2 EGFP-bar质粒的构建 | 第39页 |
| 3.2.3 Cas9-bar-gRNA-EGFP质粒和EGFP-bar质粒导入罗伯茨绿僵菌 | 第39页 |
| 3.2.4 蛋白印记检测验证Cas9蛋白的存在 | 第39-40页 |
| 3.2.5 阳性转化子与空白对照的GFP蛋白表达验证 | 第40-42页 |
| 4 讨论 | 第42-43页 |
| 4.1 Cas9蛋白及sgRNA的载体构建 | 第42页 |
| 4.2 蛋白印记检测验证Cas9蛋白的存在 | 第42页 |
| 4.3 sgRNA启动子的改进 | 第42-43页 |
| 5 结论 | 第43-44页 |
| 参考文献 | 第44-51页 |
| 致谢 | 第51-52页 |
| 作者简介 | 第52页 |
