| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-13页 |
| 1 绪论 | 第13-25页 |
| ·癌症及其治疗现状 | 第13页 |
| ·分子生物学对新药研发的影响 | 第13-14页 |
| ·开发新型药物的方法 | 第14-15页 |
| ·组合生物合成 | 第14页 |
| ·高通量筛选 | 第14-15页 |
| ·功能基因组技术 | 第15页 |
| ·聚酮化合物(Polyketides,PKSs) | 第15-17页 |
| ·聚酮类生物合成基因的克隆 | 第15-16页 |
| ·聚酮化合物及聚酮合酶(Polyketide Synthases,PKS)概述 | 第16-17页 |
| ·聚酮化合物的异源表达 | 第17页 |
| ·Fostriecin的研究 | 第17-22页 |
| ·Fostriecin及其类似化合物 | 第17-18页 |
| ·Fostriecin的作用机理 | 第18-20页 |
| ·Fostriecin的化学全合成简介 | 第20页 |
| ·Fostriecin的生物合成机制 | 第20-22页 |
| ·Fostriecin生物合成后修饰基因fosH的异源表达 | 第22-23页 |
| ·fosH基因功能预测 | 第22-23页 |
| ·大肠杆菌表达系统 | 第23页 |
| ·立题的背景和意义 | 第23-24页 |
| ·立题依据和主要内容 | 第24-25页 |
| ·立题依据 | 第24页 |
| ·主要内容 | 第24-25页 |
| 2 目的基因的克隆 | 第25-42页 |
| ·引言 | 第25页 |
| ·材料与设备 | 第25-28页 |
| ·菌株与质粒 | 第25页 |
| ·主要试剂及试剂盒 | 第25-26页 |
| ·主要仪器 | 第26-27页 |
| ·培养基 | 第27页 |
| ·主要溶液 | 第27-28页 |
| ·DNA分子量标准 | 第28页 |
| ·PCR引物 | 第28页 |
| ·实验方法 | 第28-32页 |
| ·大肠杆菌的培养方法 | 第28页 |
| ·SDS碱裂解法制备质粒DNA(小量制备) | 第28-29页 |
| ·质粒的酶切 | 第29页 |
| ·目的DNA片段的回收 | 第29-30页 |
| ·目的片段的连接 | 第30页 |
| ·氯化钙法制备大肠杆菌感受态 | 第30页 |
| ·连接反应物的转化 | 第30-31页 |
| ·蓝白斑筛选 | 第31页 |
| ·PCR初步筛选重组转化子 | 第31页 |
| ·酶切检测重组载体 | 第31-32页 |
| ·fosH基因表达载体的构建 | 第32-33页 |
| ·PCR扩增fosH基因 | 第32页 |
| ·DNA片段和线性载体的纯化回收 | 第32页 |
| ·DNA片段与载体的连接 | 第32-33页 |
| ·大肠杆菌质粒检测 | 第33页 |
| ·大肠杆菌细胞BL21的转化 | 第33页 |
| ·鉴定大肠杆菌BL21转化子 | 第33页 |
| ·酶切鉴定 | 第33页 |
| ·PCR法鉴定 | 第33页 |
| ·DNA测序 | 第33页 |
| ·结果与讨论 | 第33-40页 |
| ·fosH基因片段的纯化回收 | 第33-36页 |
| ·表达载体的构建和鉴定 | 第36-40页 |
| ·本章小结 | 第40-42页 |
| 3 目标基因的异源表达及分离纯化 | 第42-52页 |
| ·引言 | 第42页 |
| ·目标基因的诱导表达 | 第42页 |
| ·靶蛋白的分离纯化 | 第42页 |
| ·材料与设备 | 第42-44页 |
| ·主要试剂 | 第42-43页 |
| ·主要仪器及设备 | 第43页 |
| ·主要溶液 | 第43-44页 |
| ·蛋白Marker | 第44页 |
| ·大肠杆菌发酵培养基 | 第44页 |
| ·实验方法 | 第44-48页 |
| ·目的基因fosH1、fosH2的诱导表达 | 第44-45页 |
| ·诱导条件的优化 | 第45页 |
| ·靶蛋白的大量表达 | 第45页 |
| ·样品处理 | 第45-46页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第46-47页 |
| ·重组大肠杆菌可溶性总蛋白的提取 | 第47-48页 |
| ·过镍离子亲和层析柱纯化目的蛋白 | 第48页 |
| ·超滤法浓缩目标蛋白 | 第48页 |
| ·结果与讨论 | 第48-51页 |
| ·诱导条件的确定 | 第48-49页 |
| ·靶蛋白表达量检测 | 第49页 |
| ·菌体破碎条件的确立 | 第49-50页 |
| ·目标蛋白的纯化结果 | 第50-51页 |
| ·本章小结 | 第51-52页 |
| 4 HPLC制备目标蛋白底物——DP-Fostriecin | 第52-64页 |
| ·引言 | 第52页 |
| ·材料与设备 | 第52-53页 |
| ·主要试剂 | 第52页 |
| ·主要仪器及设备 | 第52-53页 |
| ·主要溶液 | 第53页 |
| ·Fostriecin标准样品 | 第53页 |
| ·实验方法 | 第53-57页 |
| ·反相色谱(RPC) | 第53-54页 |
| ·C18反相柱流动相的选择 | 第54页 |
| ·样品及流动相的处理 | 第54-55页 |
| ·C18反相柱使用前准备 | 第55页 |
| ·Fostriecin紫外吸收及保留时间的确定 | 第55页 |
| ·Fostriecin在不同溶剂中的性质 | 第55页 |
| ·Fostriecin粗产品的HPLC制备 | 第55-56页 |
| ·利用柱层析方法进一步纯化Fostriecin收集液 | 第56页 |
| ·Fostriecin的结构鉴定 | 第56页 |
| ·Fostriecin的去磷酸化反应条件的摸索及扩大反应 | 第56-57页 |
| ·DP-Fostriecin的纯化以及结构鉴定 | 第57页 |
| ·结果与讨论 | 第57-63页 |
| ·Fostriecin的紫外吸收及保留时间确定 | 第57-58页 |
| ·Fostriecin制备条件的确定 | 第58-59页 |
| ·Fostriecin的制备结果 | 第59-60页 |
| ·Fostriecin去磷酸反应条件的确立 | 第60-62页 |
| ·DP-Fostriecin制备条件的确定 | 第62页 |
| ·DP-Fostriecin的制备结果 | 第62页 |
| ·Fostriecin和DP-Fostriecin的结构鉴定 | 第62-63页 |
| ·本章小结 | 第63-64页 |
| 5 目的蛋白的功能鉴定 | 第64-70页 |
| ·引言 | 第64页 |
| ·材料与设备 | 第64-65页 |
| ·主要试剂 | 第64页 |
| ·主要仪器及设备 | 第64-65页 |
| ·主要溶液 | 第65页 |
| ·底物 | 第65页 |
| ·实验方法 | 第65-66页 |
| ·目标蛋白FosH1/FosH2的活性测定 | 第65-66页 |
| ·HPLC检测反应液 | 第66页 |
| ·结果与讨论 | 第66-69页 |
| ·底物的稳定性及纯度测定结果 | 第66-67页 |
| ·fosH基因的功能定位 | 第67-69页 |
| ·本章小结 | 第69-70页 |
| 结论 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-76页 |
| 附录A Fostriecin及DP-Fostriecin电喷雾电离质谱图(ESI-MS) | 第76-77页 |
| 附录B-1 Fostriecin ~1H NMR谱图 | 第77-80页 |
| 附录B-2 DP-Fostriecin ~1HNMR谱图 | 第80-83页 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 | 第83-84页 |
| 致谢 | 第84-86页 |
