| 摘要 | 第12-14页 |
| 英文摘要 | 第14-16页 |
| 英文缩略语表 | 第16-17页 |
| 1 文献综述 | 第17-29页 |
| 1.1 研究背景 | 第17页 |
| 1.2 牛病毒性腹泻-粘膜病的研究进展 | 第17-21页 |
| 1.2.1 分布与危害 | 第17页 |
| 1.2.2 BVDV种属和分型 | 第17-18页 |
| 1.2.3 流行病学 | 第18-19页 |
| 1.2.4 临床症状 | 第19-20页 |
| 1.2.4.1 BVDV急性感染 | 第19页 |
| 1.2.4.2 BVDV持续性感染 | 第19-20页 |
| 1.2.5 BVDV与机体免疫应答 | 第20-21页 |
| 1.3 程序性细胞死亡蛋白-1的概述 | 第21-26页 |
| 1.3.1 PD-1/PD-L1 蛋白生物学特性 | 第21-22页 |
| 1.3.2 PD-1/PD-L1 通路研究进展 | 第22-24页 |
| 1.3.2.1 PD-1 在病毒感染中的作用 | 第22-23页 |
| 1.3.2.2 PD-1 在肿瘤免疫中的作用 | 第23-24页 |
| 1.3.3 抗PD-1/PD-L1 抗体的应用价值 | 第24-25页 |
| 1.3.3.1 抗PD-1/PD-L1 抗体产品的临床应用 | 第24页 |
| 1.3.3.2 抗PD-1/PD-L1 抗体的抗病毒感染治疗 | 第24-25页 |
| 1.3.4 兽用抗PD-1/PD-L1 抗体的研究与应用 | 第25-26页 |
| 1.4 展望 | 第26-27页 |
| 1.5 研究目的和意义 | 第27-29页 |
| 2 牛外周血淋巴细胞PD-1 胞外区蛋白的原核表达及鉴定 | 第29-43页 |
| 2.1 材料 | 第29-30页 |
| 2.1.1 载体和细胞 | 第29页 |
| 2.1.2 试剂 | 第29-30页 |
| 2.1.3 仪器与设备 | 第30页 |
| 2.2 方法 | 第30-34页 |
| 2.2.1 目的基因片段的扩增与纯化 | 第30-31页 |
| 2.2.2 牛PD-1 胞外区基因片段与PMD18-T克隆载体连接 | 第31-32页 |
| 2.2.3 构建牛PET-28A(+)-PD-1 原核表达载体 | 第32页 |
| 2.2.4 牛PD-1 胞外区蛋白的表达及可溶性分析 | 第32-33页 |
| 2.2.5 牛PD-1 胞外区蛋白WESTERN-BLOT鉴定 | 第33页 |
| 2.2.6 牛PD-1 胞外区蛋白纯化 | 第33-34页 |
| 2.2.7 牛PD-1 胞外区蛋白的复性和浓缩 | 第34页 |
| 2.3 结果 | 第34-41页 |
| 2.3.1 牛PD-1 胞外区基因的PCR鉴定及序列分析 | 第34-35页 |
| 2.3.2 PMD18-T-PD-1 重组克隆质粒的构建 | 第35页 |
| 2.3.3 牛PD-1 胞外区的生物信息学分析 | 第35-38页 |
| 2.3.3.1 牛PD-1 胞外区的理化性质 | 第35-36页 |
| 2.3.3.2 氨基酸的组成和疏水性分析 | 第36-37页 |
| 2.3.3.3 氨基酸的磷酸化位点分析 | 第37-38页 |
| 2.3.3.4 牛PD-1 胞外区蛋白的高级结构预测 | 第38页 |
| 2.3.4 PET-28A(+)-PD-1 重组表达质粒的构建 | 第38-39页 |
| 2.3.5 PD-1-PET-28A(+)重组蛋白的表达及可溶性分析 | 第39-40页 |
| 2.3.6 PD-1-PET-28A(+)重组蛋白的纯化与WESTERN BLOT鉴定 | 第40-41页 |
| 2.4 讨论 | 第41-42页 |
| 2.5 小结 | 第42-43页 |
| 3 抗PD-1 多抗阻断对BVDV感染的外周血淋巴细胞增殖和凋亡的影响 | 第43-55页 |
| 3.1 材料 | 第43页 |
| 3.1.1 毒株和细胞 | 第43页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第43页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第43页 |
| 3.2 方法 | 第43-46页 |
| 3.2.1 牛PD-1 胞外区重组蛋白多抗的制备和鉴定 | 第43-44页 |
| 3.2.2 Q-PCR检测病毒拷贝数 | 第44-45页 |
| 3.2.2.1 BVDV Q-PCR标准品的制备 | 第44-45页 |
| 3.2.2.2 BVDV标准曲线的建立 | 第45页 |
| 3.2.2.3 BVDV拷贝数检测 | 第45页 |
| 3.2.3 CCK-8 细胞增殖检测 | 第45-46页 |
| 3.2.4 细胞凋亡检测 | 第46页 |
| 3.2.5 数据分析 | 第46页 |
| 3.3 结果 | 第46-51页 |
| 3.3.1 PD-1-PET-28A(+)重组蛋白多抗效价检测 | 第46-47页 |
| 3.3.2 PD-1-PET-28A(+)重组蛋白多抗抗原性检测 | 第47页 |
| 3.3.3 BVDV标准曲线的建立及BVDV病毒量检测 | 第47-49页 |
| 3.3.4 CCK-8 细胞增殖检测淋巴细胞活性 | 第49页 |
| 3.3.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 | 第49-51页 |
| 3.4 讨论 | 第51-53页 |
| 3.5 小结 | 第53-55页 |
| 4 抗牛PD-1 胞外区蛋白单克隆抗体的制备和鉴定 | 第55-65页 |
| 4.1 材料 | 第55-56页 |
| 4.1.1 细胞和动物 | 第55页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第55-56页 |
| 4.1.3 主要仪器 | 第56页 |
| 4.2 方法 | 第56-60页 |
| 4.2.1 免疫原的制备和免疫动物 | 第56页 |
| 4.2.2 小鼠血清抗体效价检测 | 第56页 |
| 4.2.3 骨髓瘤细胞SP2/0 的扩增培养 | 第56页 |
| 4.2.4 饲细胞的制备 | 第56-57页 |
| 4.2.5 细胞融合 | 第57页 |
| 4.2.6 单抗的杂交瘤细胞株的建立 | 第57页 |
| 4.2.7 杂交瘤上清单抗效价的测定 | 第57页 |
| 4.2.8 单克隆抗体鉴定 | 第57-60页 |
| 4.2.8.1 杂交瘤上清WESTERN-BLOT检测 | 第57-58页 |
| 4.2.8.2 牛PD-1 全长基因的克隆 | 第58页 |
| 4.2.8.3 牛PD-1-PCDNA-3.1(+)重组质粒构建 | 第58-59页 |
| 4.2.8.4 牛PD-1-PCDNA-3.1(+)重组质粒转染CHO细胞 | 第59页 |
| 4.2.8.5 细胞间接免疫荧光检测 | 第59-60页 |
| 4.3 结果 | 第60-63页 |
| 4.3.1 小鼠血清抗体效价检测 | 第60页 |
| 4.3.2 杂交瘤细胞株的建立 | 第60-61页 |
| 4.3.3 杂交瘤细胞上清单抗SDS-PAGE检测 | 第61页 |
| 4.3.4 杂交瘤上清单抗WESTERN-BLOT检测 | 第61-62页 |
| 4.3.5 牛PD-1 全长基因的克隆 | 第62页 |
| 4.3.6 牛PD-1-PCDNA-3.1(+)重组质粒鉴定 | 第62页 |
| 4.3.7 细胞间接免疫荧光检测 | 第62-63页 |
| 4.4 讨论 | 第63-64页 |
| 4.5 小结 | 第64-65页 |
| 5 结论 | 第65-67页 |
| 参考文献 | 第67-79页 |
| 致谢 | 第79-81页 |
| 附录 | 第81-83页 |
| 个人简历 | 第83页 |
