| 摘要 | 第4-6页 |
| abstract | 第6-8页 |
| 引言 | 第20-22页 |
| 1 文献综述 | 第22-32页 |
| 1.1 骨骼肌研究进展 | 第22-25页 |
| 1.1.1 骨骼肌的形成 | 第22-23页 |
| 1.1.2 骨骼肌的调控因子 | 第23-24页 |
| 1.1.3 骨骼肌的修复 | 第24页 |
| 1.1.4 骨骼肌的信号通路 | 第24-25页 |
| 1.2 miRNAs的研究进展 | 第25-27页 |
| 1.2.1 miRNA的合成及作用机理 | 第25-26页 |
| 1.2.2 miRNAs在骨骼肌发育中的作用 | 第26-27页 |
| 1.3 miR-452研究进展 | 第27页 |
| 1.4 靶基因的研究进展 | 第27-32页 |
| 1.4.1 ANGPT1基因研究进展 | 第27-28页 |
| 1.4.2 CACNB4基因研究进展 | 第28-29页 |
| 1.4.3 RB1基因研究进展 | 第29页 |
| 1.4.4 BCL2基因研究进展 | 第29页 |
| 1.4.5 BTG2基因研究进展 | 第29-30页 |
| 1.4.6 MBNL1基因研究进展 | 第30页 |
| 1.4.7 PAX5基因研究进展 | 第30-32页 |
| 2 miR-452不同发育时期、不同组织表达谱分析 | 第32-40页 |
| 2.1 实验材料与试剂 | 第32页 |
| 2.1.1 组织采集 | 第32页 |
| 2.1.2 实验试剂、设备 | 第32页 |
| 2.2 实验方法 | 第32-35页 |
| 2.2.1 生物信息来源 | 第32页 |
| 2.2.2 定量引物设计 | 第32-33页 |
| 2.2.3 组织总RNA提取 | 第33页 |
| 2.2.4 提取后RNA的质量检测 | 第33页 |
| 2.2.5 不同组织的cDNA合成 | 第33-34页 |
| 2.2.6 实时荧光定量PCR | 第34-35页 |
| 2.3 实验结果 | 第35-38页 |
| 2.3.1 生物学分析结果 | 第35-36页 |
| 2.3.2 RNA电泳验证 | 第36-37页 |
| 2.3.3 miR-452在湖羊胎羊和成年羊组织中的表达谱 | 第37-38页 |
| 2.4 讨论 | 第38-39页 |
| 2.5 小结 | 第39-40页 |
| 3 构建miR-452过表达载体 | 第40-48页 |
| 3.1 实验材料与试剂 | 第40页 |
| 3.1.1 实验材料 | 第40页 |
| 3.1.2 实验试剂、仪器 | 第40页 |
| 3.2 实验方法 | 第40-44页 |
| 3.2.1 湖羊基因组DNA提取 | 第40页 |
| 3.2.2 Pri-miR-452前体序列的扩增 | 第40-42页 |
| 3.2.3 目的片段的酶切 | 第42-43页 |
| 3.2.4 酶切后目的片段和载体的连接 | 第43-44页 |
| 3.2.5 酶连产物转化到Trans5α感受态细胞 | 第44页 |
| 3.2.6 从菌液中抽提质粒 | 第44页 |
| 3.2.7 pcDNA3.1-pri-miR-452质粒转染H293T细胞 | 第44页 |
| 3.3 结果 | 第44-47页 |
| 3.3.1 miR-452片段扩增图 | 第45-46页 |
| 3.3.2 pcDNA3.1(+)-miR-452在H293T中的表达效率 | 第46-47页 |
| 3.4 讨论 | 第47页 |
| 3.5 小结 | 第47-48页 |
| 4 miR-452对小鼠成肌细胞增殖的影响 | 第48-64页 |
| 4.1 实验所用材料与试剂 | 第48-49页 |
| 4.1.1 实验材料 | 第48页 |
| 4.1.2 实验所用试剂、仪器 | 第48-49页 |
| 4.2 实验方法 | 第49-51页 |
| 4.2.1 成肌细胞的复苏和培养 | 第49页 |
| 4.2.2 成肌细胞铺板与转染 | 第49-50页 |
| 4.2.3 细胞总RNA提取 | 第50页 |
| 4.2.4 实时荧光定量PCR | 第50页 |
| 4.2.5 WesternBlot实验 | 第50页 |
| 4.2.6 CCK-8实验 | 第50-51页 |
| 4.3 实验结果 | 第51-62页 |
| 4.3.1 成肌细胞正常增殖条件下miR-452及Ki67、Pax7、CDK1的表达趋势 | 第51-52页 |
| 4.3.2 过表达或者抑制miR-452后成肌细胞的增殖情况 | 第52-62页 |
| 4.4 讨论 | 第62-63页 |
| 4.5 小结 | 第63-64页 |
| 5 miR-452对小鼠成肌细胞分化的影响 | 第64-80页 |
| 5.1 实验所用材料与试剂 | 第64页 |
| 5.1.1 实验所用试剂、仪器 | 第64页 |
| 5.2 实验方法 | 第64-66页 |
| 5.2.1 分化标志基因引物设计 | 第64-65页 |
| 5.2.2 成肌细胞培养和诱导分化 | 第65页 |
| 5.2.3 成肌细胞的转染 | 第65页 |
| 5.2.4 成肌细胞总RNA的提取 | 第65页 |
| 5.2.5 实时荧光定量PCR | 第65-66页 |
| 5.2.6 WesternBlot | 第66页 |
| 5.3 实验结果 | 第66-78页 |
| 5.3.1 过表达或抑制miR-452后成肌细胞第7天分化细胞图 | 第66-67页 |
| 5.3.2 过表达或抑制miR-452后成肌细胞的分化情况 | 第67-78页 |
| 5.4 讨论 | 第78-79页 |
| 5.5 小结 | 第79-80页 |
| 6 miR-452靶向ANGPT1促进成肌细胞增殖抑制成肌细胞分化 | 第80-108页 |
| 6.1 实验所用材料与试剂 | 第80-81页 |
| 6.1.1 实验材料 | 第80-81页 |
| 6.1.2 实验试剂、仪器 | 第81页 |
| 6.2 实验方法 | 第81-85页 |
| 6.2.1 湖羊基因组DNA提取 | 第81页 |
| 6.2.2 miR-452靶基因预测 | 第81-82页 |
| 6.2.3 候选靶基因双荧光素酶载体的构建(野生型) | 第82-84页 |
| 6.2.4 靶基因荧光载体的构建(突变型) | 第84-85页 |
| 6.3 靶基因验证 | 第85-87页 |
| 6.3.1 靶基因野生型和突变型质粒提取和细胞转染 | 第85-86页 |
| 6.3.2 双荧光素酶报告基因实验 | 第86页 |
| 6.3.3 WesternBlot验证ANGPT1和CACNB4与miR-452的靶向关系 | 第86-87页 |
| 6.4 干扰靶基因ANGPT1对成肌细胞增殖与分化的实验 | 第87-88页 |
| 6.4.1 成肌细胞的培养及诱导增殖、分化 | 第87页 |
| 6.4.2 细胞铺板与转染 | 第87页 |
| 6.4.3 实时荧光定量和WesternBlot检测si-ANGPT1干扰的效率 | 第87-88页 |
| 6.4.4 干扰ANGPT1后,CCK-8检测细胞增殖、EdU检测细胞增殖、WesternBlot检测增殖标志基因和分化标志基因的蛋白表达量 | 第88页 |
| 6.5 实验结果 | 第88-105页 |
| 6.5.1 双荧光素酶野生型载体的构建 | 第88-91页 |
| 6.5.2 双荧光素酶突变型载体的构建 | 第91-94页 |
| 6.5.3 miR-452与预测靶基因之间的靶向关系 | 第94-100页 |
| 6.5.4 过表达或抑制miR-452对ANGPT1和CACNB4基因蛋白表达的影响 | 第100-101页 |
| 6.5.5 干扰ANGPT1后,ANGPT1mRNA水平表达结果 | 第101页 |
| 6.5.6 干扰ANGPT1后,ANGPT1蛋白水平表达结果 | 第101-102页 |
| 6.5.7 干扰ANGPT1后,细胞增殖标志基因Pax7、CDK1蛋白表达结果 | 第102-103页 |
| 6.5.8 干扰ANGPT1后,CCK-8检测细胞增殖结果 | 第103-104页 |
| 6.5.9 干扰ANGPT1后,EdU检测细胞增殖结果 | 第104页 |
| 6.5.10 干扰ANGPT1后,细胞分化标志基因MyoG、Myf5、Mef2c蛋白表达结果 | 第104-105页 |
| 6.6 讨论 | 第105-107页 |
| 6.7 小结 | 第107-108页 |
| 7 结论与创新点 | 第108-110页 |
| 7.1 结论 | 第108页 |
| 7.2 创新点 | 第108-110页 |
| 参考文献 | 第110-126页 |
| 附录 | 第126-138页 |
| 附录1 实验所用仪器与试剂 | 第126-128页 |
| 附录2 组织和细胞总RNA的提取 | 第128-129页 |
| 附录3 肌肉组织DNA的提取 | 第129-130页 |
| 附录4 转化实验 | 第130页 |
| 附录5 质粒提取实验 | 第130-131页 |
| 附录6 细胞转染实验 | 第131页 |
| 附录7 细胞总蛋白提取实验 | 第131-132页 |
| 附录8 BCA蛋白浓度测定实验 | 第132页 |
| 附录9 WesternBlot实验 | 第132-135页 |
| 附录10 双荧光素酶报告基因实验 | 第135页 |
| 附录11 EdU细胞免疫荧光实验 | 第135-138页 |
| 致谢 | 第138-140页 |
| 作者简历 | 第140-142页 |
| 学位论文数据集 | 第142页 |
