| 摘要 | 第8-9页 |
| ABSTRACT | 第9-10页 |
| 第1章 引言 | 第11-22页 |
| 1.1 纤维素酶 | 第11-12页 |
| 1.2 纤维素酶的应用 | 第12-14页 |
| 1.3 国内外内切葡聚糖酶基因的研究 | 第14-16页 |
| 1.3.1 在细菌系统中克隆与表达 | 第14-15页 |
| 1.3.2 在酵母系统中的克隆与表达 | 第15-16页 |
| 1.4 基因的异源表达相关研究 | 第16-18页 |
| 1.4.1 原核表达体系—大肠杆菌表达系统 | 第16-17页 |
| 1.4.2 真核表达体系—毕赤酵母表达系统 | 第17-18页 |
| 1.5 纤维素内切葡聚糖酶催化域研究 | 第18-22页 |
| 1.5.1 葡聚糖酶催化域 | 第18-19页 |
| 1.5.2 内切葡聚糖酶EG催化域理性设计 | 第19-22页 |
| 第2章 长枝木霉内切葡聚糖酶egI基因在大肠杆菌中的表达 | 第22-31页 |
| 2.1 实验材料 | 第22页 |
| 2.1.1 质粒和菌株 | 第22页 |
| 2.1.2 各类试剂和仪器 | 第22页 |
| 2.2 实验方法 | 第22-26页 |
| 2.2.1 egI基因的扩增 | 第22-23页 |
| 2.2.2 重组表达载体的构建 | 第23-24页 |
| 2.2.3 DH5 α感受态细胞的制备 | 第24页 |
| 2.2.4 连接子的热击转化 | 第24页 |
| 2.2.5 重组子质粒验证 | 第24-25页 |
| 2.2.6 刚果红平板检测酶活力 | 第25页 |
| 2.2.7 葡聚糖内切酶(egI)的诱导表达 | 第25页 |
| 2.2.8 重组蛋白SDS-PAGE分析 | 第25-26页 |
| 2.2.9 内切葡糖酶羧甲基纤维素钠(CMC-Na)酶活测定 | 第26页 |
| 2.3 结果与分析 | 第26-29页 |
| 2.3.1 内切葡聚糖酶egI目的基因扩增 | 第26-27页 |
| 2.3.2 原核表达载体构建 | 第27页 |
| 2.3.3 重组质粒测序 | 第27页 |
| 2.3.4 egI基因在大肠杆菌BL21(DE3)表达 | 第27-28页 |
| 2.3.5 葡萄糖标准曲线的制作 | 第28-29页 |
| 2.3.6 重组大肠杆菌表达egI的CMC酶活测定 | 第29页 |
| 2.4 小结 | 第29-31页 |
| 第3章 长枝木霉内切葡聚糖酶egI基因在毕赤酵母中的表达 | 第31-47页 |
| 3.1 实验材料 | 第31页 |
| 3.1.1 质粒和菌株 | 第31页 |
| 3.1.2 各类试剂和仪器 | 第31页 |
| 3.2 实验方法 | 第31-36页 |
| 3.2.1 重组葡聚糖内切酶基因pPIC9K-egI载体构建 | 第31-32页 |
| 3.2.2 质粒转化及验证 | 第32页 |
| 3.2.3 毕赤酵母GS115生长曲线的测定 | 第32页 |
| 3.2.4 毕赤酵母电击转化 | 第32-33页 |
| 3.2.5 简单玻璃珠法提取酵母DNA | 第33页 |
| 3.2.6 PCR验证重组毕赤酵母载体 | 第33-34页 |
| 3.2.7 刚果红平板显色反应 | 第34页 |
| 3.2.8 改良的苯酚法提取上清酶液蛋白 | 第34-35页 |
| 3.2.9 两次电击转化,筛选高G418抗性转化子 | 第35页 |
| 3.2.10 高G418抗性转化子的诱导表达: | 第35-36页 |
| 3.2.11 重组子CMC酶活性质 | 第36页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第36-44页 |
| 3.3.1 重组质粒pPIC9K-egI构建 | 第36页 |
| 3.3.2 重组质粒pPIC9K-egI的DNA线性化 | 第36-37页 |
| 3.3.3 毕赤酵母细胞的生长曲线的测定 | 第37-38页 |
| 3.3.4 毕赤酵母细胞不同生长状态对转化率的影响 | 第38页 |
| 3.3.5 电场强度对转化效率的影响 | 第38-39页 |
| 3.3.6 外源DNA浓度对转化效率的影响 | 第39页 |
| 3.3.7 阳性转化子的验证 | 第39-40页 |
| 3.3.8 重组表达酵母细胞上清SDS-PAGE分析 | 第40-41页 |
| 3.3.9 刚果红显色反应验证重组毕赤酵母细胞分泌表达 | 第41页 |
| 3.3.10 高G418抗性菌株平板筛选 | 第41-42页 |
| 3.3.11 高G418抗性菌株的生长曲线比较 | 第42页 |
| 3.3.12 高G418抗性菌株酶活性比较 | 第42-43页 |
| 3.3.13 高G418抗性菌株产egI最适反应温度比较 | 第43页 |
| 3.3.14 高G418抗性菌株产egI最适催化pH值比较 | 第43-44页 |
| 3.4 小结 | 第44-47页 |
| 第4章 内切葡聚糖酶egI催化域关键氨基酸研究 | 第47-56页 |
| 4.1 材料 | 第47页 |
| 4.1.1 质粒和菌株 | 第47页 |
| 4.1.2 试剂与仪器 | 第47页 |
| 4.2 实验方法 | 第47-51页 |
| 4.2.1 egI催化域分析 | 第47-48页 |
| 4.2.2 催化域部分截断表达载体构建 | 第48页 |
| 4.2.3 质粒热击转化大肠杆菌Top10及验证 | 第48-49页 |
| 4.2.4 重组催化域阶段片段载体电击转化毕赤酵母 | 第49页 |
| 4.2.5 PCR验证重组毕赤酵母载体 | 第49页 |
| 4.2.6 催化域截断片段酵母工程菌株表达及表达产物的酶活测定 | 第49页 |
| 4.2.7 点突变表达载体构建 | 第49-50页 |
| 4.2.8 点突变载体电击转化毕赤酵母 | 第50页 |
| 4.2.9 PCR验证点突变重组毕赤酵母载体 | 第50页 |
| 4.2.10 点突变重组酵母表达及酶活测定 | 第50-51页 |
| 4.3 结果与分析 | 第51-54页 |
| 4.3.1 egI催化域部分敲除片段基因扩增 | 第51页 |
| 4.3.2 部分催化域氨基酸敲除重组载体物理图谱 | 第51-52页 |
| 4.3.3 重组子酶活力测定 | 第52页 |
| 4.3.4 点突变载体构建 | 第52-53页 |
| 4.3.5 点突变重组表达载体测序结果 | 第53页 |
| 4.3.6 点突变重组表达载体表达及酶活测定 | 第53-54页 |
| 4.4 小结与讨论 | 第54-56页 |
| 总结与展望 | 第56-58页 |
| 参考文献 | 第58-62页 |
| 附录 | 第62-64页 |
| 致谢 | 第64页 |
