| 摘要 | 第2-4页 |
| ABSTRACT | 第4-5页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-20页 |
| 1.1 纳米粒子相关性质 | 第11-13页 |
| 1.2 p53与肿瘤发生 | 第13-14页 |
| 1.3 p53新靶基因Rap2b的发现及其研究进展 | 第14-19页 |
| 1.4 研究目的和意义 | 第19-20页 |
| 第二章 材料与方法 | 第20-47页 |
| 2.1 实验材料 | 第20-24页 |
| 2.1.1 质粒 | 第20页 |
| 2.1.2 实验动物和细胞系 | 第20页 |
| 2.1.3 试剂 | 第20-21页 |
| 2.1.4 仪器设备 | 第21页 |
| 2.1.5 基本试剂配制 | 第21-24页 |
| 2.2 技术路线及实验方法 | 第24-47页 |
| 2.2.1 技术路线 | 第24-25页 |
| 2.2.1.1 Rap2b在肿瘤治疗中的应用 | 第24-25页 |
| 2.2.1.2 Rap2b与p53之间的相互作用 | 第25页 |
| 2.2.2 引物设计 | 第25-27页 |
| 2.2.3 金纳米壳(Gold nanoshells,GNs)及其药物偶联复合物的制备 | 第27-28页 |
| 2.2.3.1 金纳米壳的合成 | 第27-28页 |
| 2.2.3.2 金纳米壳偶联阿霉素 | 第28页 |
| 2.2.3.3 金纳米壳偶联siRap2b | 第28页 |
| 2.2.4 MTT法 | 第28-29页 |
| 2.2.5 体内药物治疗实验 | 第29页 |
| 2.2.6 GST Pulldown实验 | 第29-30页 |
| 2.2.7 Pulldown技术检测Rap2b和p53之间相互作用 | 第30-31页 |
| 2.2.8 Pulldown技术检测Rap2b截短突变体和p53之间相互作用 | 第31-32页 |
| 2.2.9 Pulldown技术检测Rap2b和p53截短突变体之间的相互作用 | 第32-33页 |
| 2.2.10 免疫印迹实验 | 第33-34页 |
| 2.2.11 酶联免疫吸附试验(ELISA) | 第34-35页 |
| 2.2.12 分子克隆 | 第35-38页 |
| 2.2.12.1 聚合酶链式反应 | 第35-36页 |
| 2.2.12.2 PCR产物纯化 | 第36页 |
| 2.2.12.3 目的基因与载体酶切 | 第36页 |
| 2.2.12.4 酶切产物回收 | 第36页 |
| 2.2.12.5 载体与目的基因片段连接 | 第36-37页 |
| 2.2.12.6 连接产物转化大肠杆菌 | 第37页 |
| 2.2.12.7 菌落PCR | 第37页 |
| 2.2.12.8 提质粒 | 第37-38页 |
| 2.2.12.9 重组质粒的酶切鉴定 | 第38页 |
| 2.2.13 蛋白诱导及纯化 | 第38-40页 |
| 2.2.13.1 质粒转化 | 第38页 |
| 2.2.13.2 蛋白诱导表达 | 第38-39页 |
| 2.2.13.3 蛋白纯化 | 第39-40页 |
| 2.2.14 蛋白质浓度测定 | 第40页 |
| 2.2.15 SDS-PAGE电泳 | 第40-41页 |
| 2.2.16 RNA的提取 | 第41页 |
| 2.2.17 荧光定量PCR (qRT-PCR) | 第41-42页 |
| 2.2.18 细胞培养 | 第42-44页 |
| 2.2.18.1 细胞复苏 | 第42页 |
| 2.2.18.2 细胞传代 | 第42页 |
| 2.2.18.3 细胞冻存 | 第42-43页 |
| 2.2.18.4 阿霉素处理细胞及收集 | 第43页 |
| 2.2.18.5 细胞转染 | 第43-44页 |
| 2.2.19 Hoechst 33258染色 | 第44页 |
| 2.2.20 Rap2b单克隆抗体的制备 | 第44-47页 |
| 第三章 结果与分析 | 第47-74页 |
| 第一部分 Rap2b单克隆抗体的制备 | 第47-50页 |
| 3.1 融合及筛选效果 | 第47页 |
| 3.2 单克隆抗体亚型的鉴定 | 第47页 |
| 3.3 Rap2b单克隆抗体抗原表位鉴定 | 第47-48页 |
| 3.4 Rap2b单克隆抗体检测极限的鉴定 | 第48-50页 |
| 第二部分 Rap2b在肿瘤治疗中的应用 | 第50-58页 |
| 3.5 载药金纳米壳(GNs)的合成与表征 | 第50-51页 |
| 3.6 载药GNs具有良好的光热效应和释药效应 | 第51-52页 |
| 3.7 肿瘤细胞HCT116对载药GNs的摄取 | 第52页 |
| 3.8 siRap2b-GNs显著降低肿瘤细胞内Rap2b的表达水平 | 第52-54页 |
| 3.9 siRap2b-GNs显著增强Adr-GNs对肿瘤细胞的体外杀伤作用 | 第54-55页 |
| 3.10 siRap2b-GNs显著增强Adr-GNs对恶性肿瘤生长的抑制作用 | 第55-58页 |
| 第三部分 Rap2b与p53之间的相互作用 | 第58-74页 |
| 3.11 Rap2b与p53在体外直接结合 | 第58页 |
| 3.12 Rap2b蛋白的p53结合结构域的鉴定 | 第58-68页 |
| 3.12.1 Rap2b截短突变体原核表达载体的构建 | 第59-63页 |
| 3.12.2 荧光双分子载体构建 | 第63-65页 |
| 3.12.3 Rap2b及Rap2b截断突变体融合蛋白的诱导表达及纯化 | 第65-67页 |
| 3.12.4 体外pulldown实验 | 第67-68页 |
| 3.13 p53蛋白的Rap2b结合结构域的鉴定 | 第68-72页 |
| 3.13.1 p53的分子结构及截短突变体 | 第69页 |
| 3.13.2 p53及p53截短突变体融合蛋白的表达及纯化 | 第69-71页 |
| 3.13.3 体外pulldown实验 | 第71-72页 |
| 3.14 Rap2b与p53体内相互作用 | 第72-74页 |
| 第四章 讨论与总结 | 第74-79页 |
| 4.1 讨论 | 第74-78页 |
| 4.2 总结 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-84页 |
| 致谢 | 第84-85页 |
| 攻读学位期间取得的学术成果目录 | 第85-86页 |
