| 摘要 | 第2-4页 |
| ABSTRACT | 第4-5页 |
| 符号说明 | 第10-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-23页 |
| 1.1 1p53及其研究进展 | 第11-15页 |
| 1.1.1 p53基本结构与功能 | 第11-13页 |
| 1.1.1.1 p53与细胞周期 | 第12-13页 |
| 1.1.1.2 p53与细胞凋亡 | 第13页 |
| 1.1.1.3 p53与DNA损伤修复 | 第13页 |
| 1.1.2 p53蛋白的稳定性 | 第13-14页 |
| 1.1.3 p53与癌症治疗 | 第14-15页 |
| 1.2 突变p53及其功能 | 第15-19页 |
| 1.2.1 p53突变的类型 | 第15-16页 |
| 1.2.2 突变p53特性 | 第16-17页 |
| 1.2.2.1 突变p53的半衰期 | 第16-17页 |
| 1.2.2.2 突变p53的“功能缺失”与“功能获得” | 第17页 |
| 1.2.2.3 突变p53的显性负效应 | 第17页 |
| 1.2.3 突变p53的功能 | 第17-19页 |
| 1.2.3.1 突变p53与基因组不稳定 | 第17-18页 |
| 1.2.3.2 突变p53与抗凋亡 | 第18页 |
| 1.2.3.3 突变p53与细胞迁移和侵袭 | 第18-19页 |
| 1.2.3.4 突变p53与癌症 | 第19页 |
| 1.3 Rap2b及其研究进展 | 第19-22页 |
| 1.3.1 Rap2b基本结构 | 第19-20页 |
| 1.3.2 Rap2b的表达、激活及下游靶基因 | 第20-21页 |
| 1.3.3 Rap2b的定位与功能 | 第21-22页 |
| 1.4 研究目的和意义 | 第22-23页 |
| 第二章 材料与方法 | 第23-45页 |
| 2.1 实验材料与试剂 | 第23-25页 |
| 2.1.1 质粒、菌株、实验动物和细胞系 | 第23页 |
| 2.1.2 实验仪器与设备 | 第23页 |
| 2.1.3 主要实验试剂 | 第23-24页 |
| 2.1.4 常用试剂配制 | 第24-25页 |
| 2.2 实验技术路线 | 第25页 |
| 2.3 实验方法 | 第25-45页 |
| 2.3.1 引物设计 | 第25-32页 |
| 2.3.1.1 p53基因定点突变引物设计 | 第25-30页 |
| 2.3.1.2 目的基因的选择及引物设计 | 第30-31页 |
| 2.3.1.3 shRNA引物设计 | 第31-32页 |
| 2.3.1.4 荧光定量PCR引物设计 | 第32页 |
| 2.3.2 细胞总RNA提取 | 第32页 |
| 2.3.3 模板的制备 | 第32-33页 |
| 2.3.4 目的基因的扩增 | 第33-34页 |
| 2.3.5 PCR产物纯化 | 第34页 |
| 2.3.6 克隆载体的构建 | 第34-35页 |
| 2.3.7 载体与目的基因连接 | 第35-36页 |
| 2.3.8 连接产物转化大肠杆菌Stb13感受态细胞 | 第36页 |
| 2.3.9 菌落PCR | 第36页 |
| 2.3.10 质粒酶切鉴定 | 第36-37页 |
| 2.3.11 原核表达菌的构建 | 第37页 |
| 2.3.12 蛋白的诱导表达、纯化及鉴定 | 第37-39页 |
| 2.3.12.1 蛋白的小量诱导表达 | 第37-38页 |
| 2.3.12.2 目的蛋白的纯化 | 第38页 |
| 2.3.12.3 SDS-PAGE电泳 | 第38-39页 |
| 2.3.13 酶联免疫吸附试验 | 第39-40页 |
| 2.3.14 免疫印迹实验 | 第40页 |
| 2.3.15 慢病毒颗粒的包装 | 第40-41页 |
| 2.3.16 慢病毒滴度测定 | 第41页 |
| 2.3.17 病毒最适感染指数的确定 | 第41页 |
| 2.3.18 慢病毒感染细胞及稳定细胞株的获得 | 第41-42页 |
| 2.3.19 实时荧光定量PCR | 第42页 |
| 2.3.20 细胞生长曲线的测定 | 第42页 |
| 2.3.21 流式细胞术测定细胞周期 | 第42-43页 |
| 2.3.22 琼脂集落形成实验 | 第43页 |
| 2.3.23 划痕实验 | 第43页 |
| 2.3.24 药物处理细胞 | 第43-44页 |
| 2.3.25 GST pulldown实验 | 第44页 |
| 2.3.26 统计分析 | 第44-45页 |
| 第三章 结果与分析 | 第45-68页 |
| 3.1 基因克隆及重组质粒的构建 | 第45-50页 |
| 3.1.1 p53突变位点的选择及突变体的构建 | 第45-48页 |
| 3.1.2 原核表达重组质粒的构建 | 第48-50页 |
| 3.1.2.1 pET-32a-p53(h)f1及pGEX-5X-1-p53(h)f1重组质粒的构建 | 第48-49页 |
| 3.1.2.2 pET-32a-p53(h)R175H和pET-32a-p53(h)R273H重组质粒的构建 | 第49-50页 |
| 3.2 重组质粒的诱导表达及纯化 | 第50-53页 |
| 3.2.1 pET-32a-p53(h)f1及pGEX-5X-1-p53(h)f1重组质粒的诱导表达及纯化 | 第50-51页 |
| 3.2.2 pET-32a-p53(h)R175H和pET-32a-p53(h)R273H重组质粒的诱导表达及纯化 | 第51-53页 |
| 3.3 p53多克隆抗体效价测定 | 第53页 |
| 3.4 p53突变质粒转染HCT116(p53-/-)细胞及免疫印迹法检测 | 第53-54页 |
| 3.5 肿瘤细胞中p53突变与Rap2b表达水平之间的关系研究 | 第54-56页 |
| 3.5.1 构建的不同突变体对Rap2b的影响 | 第54-55页 |
| 3.5.2 几种不同细胞系中Rap2b表达水平 | 第55-56页 |
| 3.6 Rap2b在p53突变的肿瘤细胞中的功能研究 | 第56-68页 |
| 3.6.1 慢病毒滴度测定 | 第56-57页 |
| 3.6.2 慢病毒最适MOI的确定 | 第57-58页 |
| 3.6.3 Rap2b基因敲低效率检测 | 第58-59页 |
| 3.6.4 Rap2b的敲低对细胞增殖速率的影响 | 第59页 |
| 3.6.5 敲低Rap2b对细胞迁移能力的影响 | 第59-60页 |
| 3.6.6 敲低Rap2b对肿瘤细胞周期及凋亡的影响 | 第60-62页 |
| 3.6.7 敲低Rap2b水平对细胞内几种蛋白水平的影响 | 第62-63页 |
| 3.6.8 敲低Rap2b对细胞致瘤性的影响 | 第63-64页 |
| 3.6.9 突变p53功能获得与功能丢失 | 第64-68页 |
| 3.6.9.1 野生型p53及突变p53细胞对阿霉素的响应 | 第64页 |
| 3.6.9.2 Nutlin-3对p53野生型及突变型细胞的影响 | 第64-66页 |
| 3.6.9.3 GST pulldown实验检测Rap2b蛋白与突变p53蛋白直接结合情况 | 第66-68页 |
| 第四章 讨论 | 第68-72页 |
| 第五章 总结 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-82页 |
| 致谢 | 第82-83页 |
| 攻读学位期间发表的论文 | 第83-84页 |
