| 摘要 | 第12-14页 |
| Abstract | 第14-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-28页 |
| 1.1 构建高效T载体策略 | 第16-18页 |
| 1.1.1 T载体消除非重组背景 | 第16-17页 |
| 1.1.2 T载体定向克隆 | 第17-18页 |
| 1.1.3 表达型T载体 | 第18页 |
| 1.2 表达载体的启动子 | 第18-21页 |
| 1.2.1 lac启动子 | 第19-20页 |
| 1.2.2 T7启动子 | 第20页 |
| 1.2.3 pR/pL启动子 | 第20-21页 |
| 1.3 基于ELP的纯化系统 | 第21-24页 |
| 1.3.1 ELP纯化标签简介 | 第22-23页 |
| 1.3.2 ELP的可逆相变机制 | 第23页 |
| 1.3.3 ELP相变温度影响因素 | 第23-24页 |
| 1.3.4 ELP标签的断裂 | 第24页 |
| 1.4 ELP-Intein应用于pfLamA的纯化 | 第24-25页 |
| 1.4.1 pfLamA简介 | 第25页 |
| 1.4.2 pfLamA的医疗应用 | 第25页 |
| 1.5 pfLamA的分子改造 | 第25-27页 |
| 1.5.1 基于宏基因组的分子改造 | 第26页 |
| 1.5.2 表达型T载体在宏基因组的应用 | 第26-27页 |
| 1.6 研究目的及意义 | 第27-28页 |
| 第二章 一种兼具灵活克隆和高效表达功能的质粒载体的构建及其应用 | 第28-49页 |
| 2.1 材料与仪器 | 第28-32页 |
| 2.1.1 试验材料 | 第28-31页 |
| 2.1.2 主要仪器 | 第31-32页 |
| 2.2 方法 | 第32-36页 |
| 2.2.1 质粒载体pANY2的获得 | 第32-34页 |
| 2.2.2 pANY2用于定向TA克隆的功能验证 | 第34-35页 |
| 2.2.3 pANY2用于无背景粘性末端克隆的功能验证 | 第35页 |
| 2.2.4 pANY2用于蛋白表达和纯化的功能验证 | 第35-36页 |
| 2.3 结果与分析 | 第36-47页 |
| 2.3.1 质粒载体pANY2的获得 | 第36-40页 |
| 2.3.2 pANY2用于定向TA克隆的功能验证 | 第40-43页 |
| 2.3.3 pANY2用于无背景粘性末端克隆的功能验证 | 第43-46页 |
| 2.3.4 pANY2用于蛋白表达和纯化的功能验证 | 第46-47页 |
| 2.4 讨论 | 第47-49页 |
| 第三章 一种兼具灵活克隆和温度诱导型蛋白表达功能的载体的构建及功能验证 | 第49-61页 |
| 3.1 材料及仪器 | 第49-50页 |
| 3.1.1 试验材料 | 第49-50页 |
| 3.1.2 主要仪器 | 第50页 |
| 3.2 方法 | 第50-52页 |
| 3.2.1 质粒载体pANY3的获得 | 第50页 |
| 3.2.2 将内切-β-1,3-葡聚糖酶pfLamA基因克隆进pANY | 第50-51页 |
| 3.2.3 将里氏木霉内切木聚糖酶Hj-Xyn基因克隆进pANY | 第51页 |
| 3.2.4 pANY3用于蛋白表达和纯化的功能验证 | 第51-52页 |
| 3.3 结果与分析 | 第52-59页 |
| 3.3.1 质粒载体pANY3的获得 | 第52-54页 |
| 3.3.2 将内切-β-1,3-葡聚糖酶pfLamA基因克隆进pANY3 | 第54-56页 |
| 3.3.3 将里氏木霉内切木聚糖酶Hj-Xyn基因克隆进pANY | 第56-58页 |
| 3.3.4 pANY3用于蛋白表达和纯化的功能验证 | 第58-59页 |
| 3.4 讨论 | 第59-61页 |
| 第四章 双向表达载体pANY4的构建及功能验证 | 第61-73页 |
| 4.1 材料及仪器 | 第62-63页 |
| 4.1.1 试验材料 | 第62页 |
| 4.1.2 主要仪器 | 第62-63页 |
| 4.2 方法 | 第63-65页 |
| 4.2.1 质粒载体pANY4的获得 | 第63-64页 |
| 4.2.2 用pANY4克隆β-1,3-葡聚糖酶基因pfLamA | 第64-65页 |
| 4.2.3 pANY4用于双向蛋白表达和纯化的功能验证 | 第65页 |
| 4.3 结果与分析 | 第65-72页 |
| 4.3.1 质粒载体pANY4的获得 | 第65-69页 |
| 4.3.2 用pANY4克隆β-1,3-葡聚糖酶基因pfLamA | 第69-71页 |
| 4.3.3 pANY4用于双向蛋白表达和纯化的功能验证 | 第71-72页 |
| 4.4 讨论 | 第72-73页 |
| 第五章 一种基于类弹性蛋白多肽自裂解功能的表达载体的构建及功能验证 | 第73-86页 |
| 5.1 材料及仪器 | 第73-74页 |
| 5.1.1 试验材料 | 第73-74页 |
| 5.1.2 主要仪器 | 第74页 |
| 5.2 方法 | 第74-77页 |
| 5.2.1 质粒载体pANY6的获得 | 第74-75页 |
| 5.2.2 用pANY6克隆β-1,3-葡聚糖酶基因pfLamA | 第75-76页 |
| 5.2.3 pANY6-pfLamA用于ELP-Intein纯化pfLamA的条件优化 | 第76-77页 |
| 5.3 结果与分析 | 第77-85页 |
| 5.3.1 质粒载体pANY6的获得 | 第77-80页 |
| 5.3.2 用pANY6克隆β-1,3-葡聚糖酶基因pfLamA | 第80-82页 |
| 5.3.3 pANY6-pfLamA用于ELP-Intein纯化 | 第82-85页 |
| 5.4 讨论 | 第85-86页 |
| 第六章 基于pANY2构建宏基因组区段改组库并实现pfLamA的分子改造 | 第86-96页 |
| 6.1 材料及仪器 | 第86-88页 |
| 6.1.1 试验材料 | 第86-87页 |
| 6.1.2 分析软件及数据库 | 第87-88页 |
| 6.2 方法 | 第88-90页 |
| 6.2.1 土壤多样性分析 | 第88页 |
| 6.2.2 土壤总DNA提取 | 第88页 |
| 6.2.3 基于pfLamA与土壤多样性分析设计简并引物 | 第88-89页 |
| 6.2.4 全长基因获得及载体连接 | 第89-90页 |
| 6.2.5 β-1,3-葡聚糖酶筛选 | 第90页 |
| 6.3 结果与分析 | 第90-95页 |
| 6.3.1 土壤多样性分析及 | 第90-92页 |
| 6.3.2 土壤总DNA | 第92页 |
| 6.3.3 简并引物设计结果 | 第92-93页 |
| 6.3.4 全长基因获得及克隆 | 第93-94页 |
| 6.3.5 β-1,3-葡聚糖酶筛选 | 第94-95页 |
| 6.4 结论 | 第95-96页 |
| 第七章 结论 | 第96-98页 |
| 参考文献 | 第98-104页 |
| 附录 | 第104-114页 |
| 致谢 | 第114-115页 |
| 攻读学位期间发表文章 | 第115-116页 |
