| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第1章 前言 | 第15-41页 |
| 1.1 番茄红素 | 第15-17页 |
| 1.1.1 番茄红素简介 | 第15页 |
| 1.1.2 番茄红素的生理功能 | 第15-16页 |
| 1.1.2.1 抗氧化性 | 第15页 |
| 1.1.2.2 缓解糖尿病症状 | 第15页 |
| 1.1.2.3 防治心血管疾病 | 第15-16页 |
| 1.1.2.4 番茄红素的抗癌性 | 第16页 |
| 1.1.2.5 其它功能 | 第16页 |
| 1.1.3 番茄红素的主要生产方法 | 第16-17页 |
| 1.2 番茄红素的生物合成途径 | 第17-19页 |
| 1.2.1 前体的生物合成途径 | 第17-18页 |
| 1.2.2 番茄红素的合成途径 | 第18-19页 |
| 1.3 大肠杆菌产萜类化合物的合成生物学 | 第19-37页 |
| 1.3.1 常用的优化方法及策略概述 | 第19-33页 |
| 1.3.1.1 启动子工程 | 第20-21页 |
| 1.3.1.2 优化RBS | 第21-22页 |
| 1.3.1.3 基因敲除和过表达策略 | 第22-23页 |
| 1.3.1.4 优化中心代谢途径模型 | 第23-24页 |
| 1.3.1.5 靶向蛋白质组学 | 第24-25页 |
| 1.3.1.6 酶结构改造策略 | 第25-26页 |
| 1.3.1.7 CIChE策略 | 第26-27页 |
| 1.3.1.8 构建新型MVA和MEP合成路线 | 第27-29页 |
| 1.3.1.9 改善产物胞内存储环境 | 第29-30页 |
| 1.3.1.10 ~(13)C代谢分析 | 第30-31页 |
| 1.3.1.11 MAGE | 第31页 |
| 1.3.1.12 体外代谢工程 | 第31-32页 |
| 1.3.1.13 CRISPRi技术 | 第32页 |
| 1.3.1.14 基因间隔区文库和蛋白质支架策略 | 第32-33页 |
| 1.3.2 基于异源MVA途径合成萜类化合物的研究进展 | 第33-36页 |
| 1.3.3 基于异源MVA途径合成番茄红素的研究进展 | 第36-37页 |
| 1.3.3.1 以甲羟戊酸为前体的双质粒表达系统 | 第36-37页 |
| 1.3.3.2 以乙酰辅酶A为前体的3质粒表达系统 | 第37页 |
| 1.3.3.3 整合型产番茄红素工程菌株 | 第37页 |
| 1.4 本论文的研究背景、意义及研究内容 | 第37-41页 |
| 第2章 材料与方法 | 第41-54页 |
| 2.1 实验材料 | 第41-44页 |
| 2.1.1 工具酶 | 第41页 |
| 2.1.2 试剂盒 | 第41页 |
| 2.1.3 实验试剂 | 第41页 |
| 2.1.4 实验主要仪器与设备 | 第41页 |
| 2.1.5 基因及操纵子 | 第41-44页 |
| 2.1.6 菌株、质粒及引物 | 第44页 |
| 2.1.7 生物信息学软件 | 第44页 |
| 2.2 实验方法 | 第44-50页 |
| 2.2.1 培养基的配制方法 | 第44-45页 |
| 2.2.2 培养条件 | 第45-46页 |
| 2.2.2.1 大肠杆菌培养条件 | 第45页 |
| 2.2.2.2 番茄红素发酵条件 | 第45页 |
| 2.2.2.3 传代实验培养条件 | 第45页 |
| 2.2.2.4 番茄红素上罐发酵条件 | 第45-46页 |
| 2.2.3 番茄红素萃取和检测方法 | 第46页 |
| 2.2.4 化学感受态细胞制备及化学转化方法 | 第46-47页 |
| 2.2.4.1 化学感受态细胞制备 | 第46-47页 |
| 2.2.4.2 化学转化方法 | 第47页 |
| 2.2.5 电转化感受态细胞制备及电转化方法 | 第47-48页 |
| 2.2.5.1 电转化感受态细胞制备方法 | 第47页 |
| 2.2.5.2 电转化方法 | 第47-48页 |
| 2.2.6 分子生物学实验操作 | 第48-50页 |
| 2.2.6.1 限制性内切酶反应 | 第48页 |
| 2.2.6.2 T4 DNA连接酶反应 | 第48页 |
| 2.2.6.3 质粒的体外重组克隆 | 第48-49页 |
| 2.2.6.4 PCR扩增 | 第49-50页 |
| 2.2.6.5 质粒提取 | 第50页 |
| 2.2.2.6 基因组提取 | 第50页 |
| 2.2.2.7 琼脂糖凝胶DNA回收 | 第50页 |
| 2.3 大肠杆菌基因组修饰方法 | 第50-54页 |
| 2.3.1 本实验室构建的λ-Red重组方法 | 第50-53页 |
| 2.3.1.1 基因组替换策略 | 第50-52页 |
| 2.3.1.2 基因组替换操作流程 | 第52-53页 |
| 2.3.2 基于电转化靶向片段的重组方法 | 第53-54页 |
| 第3章 基于高产前体甲羟戊酸菌株构建质粒型番茄红素合成途径 | 第54-63页 |
| 3.1 引言 | 第54-55页 |
| 3.2 实验方法 | 第55-60页 |
| 3.2.1 质粒的构建 | 第55-58页 |
| 3.2.1.1 构建质粒pC3和pCL | 第55-56页 |
| 3.2.1.2 构建表达元件S1 | 第56-57页 |
| 3.2.1.3 构建装载表达元件S1的质粒 | 第57-58页 |
| 3.2.1.4 构建装载表达元件GC的质粒 | 第58页 |
| 3.2.2 工程菌株的构建 | 第58-60页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第60-62页 |
| 3.3.1 构建双质粒表达系统的组合模型 | 第60页 |
| 3.3.2 组合优化表达元件S1和GC的番茄红素得率 | 第60-62页 |
| 3.4 本章小结 | 第62-63页 |
| 第4章 整合型菌株联合质粒系统过表达限速途径合成番茄红素 | 第63-81页 |
| 4.1 引言 | 第63-64页 |
| 4.2 实验方法 | 第64-74页 |
| 4.2.1 质粒的构建 | 第64-71页 |
| 4.2.1.1 构建质粒pETF和pETANLF | 第64-65页 |
| 4.2.1.2 构建质粒pCC1S | 第65-66页 |
| 4.2.1.3 构建质粒pETLCRT | 第66-68页 |
| 4.2.1.4 构建质粒pCANLSG | 第68-69页 |
| 4.2.1.5 构建质粒pETANLFG | 第69-70页 |
| 4.2.1.6 构建质粒pCC1SF | 第70页 |
| 4.2.1.7 构建质粒pKI | 第70-71页 |
| 4.2.1.8 构建质粒pKIE和pKIS | 第71页 |
| 4.2.2 构建整合型工程菌株DH411 | 第71-74页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第74-79页 |
| 4.3.1 整合位点和方向对番茄红素合成的影响 | 第74-75页 |
| 4.3.2 构建整合型产番茄红素工程菌株 | 第75-76页 |
| 4.3.3 优化质粒表达系统 | 第76-79页 |
| 4.3.3.1 确定限速途径 | 第76-77页 |
| 4.3.3.2 比较不同来源的表达元件 | 第77页 |
| 4.3.3.3 基于质粒系统优化表达元件S1和GC的拷贝数 | 第77-78页 |
| 4.3.3.4 上调基因fni的表达水平对番茄红素合成的影响 | 第78-79页 |
| 4.4 本章小结 | 第79-81页 |
| 第5章 MVA上游途径基因组多位点整合策略对番茄红素合成的影响 | 第81-91页 |
| 5.1 引言 | 第81页 |
| 5.2 实验方法 | 第81-85页 |
| 5.2.1 质粒的构建 | 第81-83页 |
| 5.2.1.1 构建质粒pCC1SS | 第81-82页 |
| 5.2.1.2 构建质粒pBDC-Li | 第82-83页 |
| 5.2.2 工程菌株的构建 | 第83-85页 |
| 5.2.2.1 构建菌株D64E、D58E、D44E和DLE | 第83-84页 |
| 5.2.2.2 构建菌株DH413、DH415和DH417 | 第84-85页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第85-90页 |
| 5.3.1 MVA上游途径基因组多位点整合策略的初步研究 | 第85-87页 |
| 5.3.2 MVA上游途径的基因组多位点整合策略提高番茄红素合成水平 | 第87-88页 |
| 5.3.3 优化诱导剂L-阿拉伯糖的添加时间(菌株D711) | 第88-89页 |
| 5.3.4 工程菌株的综合性能参数 | 第89-90页 |
| 5.4 本章小结 | 第90-91页 |
| 第6章 整合型高产番茄红素工程菌株的代谢途径构建 | 第91-109页 |
| 6.1 引言 | 第91-92页 |
| 6.2 实验方法 | 第92-98页 |
| 6.2.1 质粒的构建 | 第92-95页 |
| 6.2.1.1 构建质粒pCC1E和pCC1G | 第92页 |
| 6.2.1.2 构建质粒pCC1ES、pCC1EG和pCC1SG | 第92-94页 |
| 6.2.1.3 构建质粒pETI | 第94页 |
| 6.2.1.4 构建质粒pETIG和pKILG | 第94-95页 |
| 6.2.2 工程菌株的构建 | 第95-98页 |
| 6.2.2.1 构建工程菌株DH412 | 第95-96页 |
| 6.2.2.2 构建工程菌株DH422 | 第96页 |
| 6.2.2.3 构建工程菌株DH432 | 第96-97页 |
| 6.2.2.4 构建工程菌株DH442 | 第97页 |
| 6.2.2.5 构建工程菌株DH414 | 第97页 |
| 6.2.2.6 构建工程菌株DH416 | 第97-98页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第98-108页 |
| 6.3.1 利用单拷贝质粒确定限速途径 | 第98-99页 |
| 6.3.2 建立可控的代谢途径拷贝数模型 | 第99页 |
| 6.3.3 建立更优的代谢途径拷贝数模型 | 第99-100页 |
| 6.3.4 番茄红素合成途径的基因组多位点整合 | 第100-101页 |
| 6.3.5 构建整合型高产番茄红素工程菌株 | 第101-103页 |
| 6.3.6 优化诱导剂L-阿拉伯糖的添加时间(菌株D442SG和DH416) | 第103-104页 |
| 6.3.7 工程菌株稳定性研究 | 第104-106页 |
| 6.3.8 工程菌株DH416的上罐发酵结果 | 第106-107页 |
| 6.3.9 菌株DH416对比文献报导E. coli工程菌株 | 第107-108页 |
| 6.4 本章小结 | 第108-109页 |
| 第7章 结论与展望 | 第109-115页 |
| 7.1 主要结论 | 第109-112页 |
| 7.2 本论文创新点 | 第112页 |
| 7.3 展望 | 第112-115页 |
| 参考文献 | 第115-128页 |
| 博士期间论文发表情况 | 第128-129页 |
| 致谢 | 第129-130页 |
| 附录1 | 第130-134页 |
| 附录2 | 第134-137页 |
| 附录3 | 第137-140页 |
| 附录4 | 第140-142页 |
