| 中文摘要 | 第4-7页 |
| Abstract | 第7-10页 |
| 缩略词表 | 第11-18页 |
| 第一章 前言 | 第18-42页 |
| 1.1 手足口病简介 | 第18-20页 |
| 1.1.1 手足口病的危害 | 第18页 |
| 1.1.2 手足口病的病因及临床症状 | 第18-20页 |
| 1.2 EV71病毒介绍 | 第20-33页 |
| 1.2.1 EV71病毒基因组及结构 | 第20-22页 |
| 1.2.2 EV71病毒感染机制 | 第22-29页 |
| 1.2.2.1 细胞受体介导的病毒入侵与脱壳 | 第22-25页 |
| 1.2.2.2 病毒的翻译与复制 | 第25-26页 |
| 1.2.2.3 病毒的组装与释放 | 第26-29页 |
| 1.2.3 EV71病毒发病机理 | 第29页 |
| 1.2.4 EV71病毒临床与分子流行病学 | 第29-33页 |
| 1.3 手足口病的治疗与预防 | 第33-37页 |
| 1.3.1 抗病毒治疗药物 | 第33-34页 |
| 1.3.2 手足口病预防性疫苗 | 第34-37页 |
| 1.4 杆状病毒表达系统的相关介绍 | 第37-38页 |
| 1.5 论文设计 | 第38-42页 |
| 1.5.1 论文目的及意义 | 第38-40页 |
| 1.5.2 论文技术路线 | 第40-42页 |
| 第二章 Sf9细胞的培养与EV71 VLPs疫苗表达的优化 | 第42-78页 |
| 2.1 主要实验材料与试剂 | 第42-48页 |
| 2.1.1 菌株、质粒与细胞 | 第42页 |
| 2.1.2 工具酶、试剂盒和其他试剂及材料 | 第42-43页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第43-44页 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 | 第44-48页 |
| 2.1.4.1 核酸实验相关溶液的配制 | 第44-45页 |
| 2.1.4.2 蛋白实验相关溶液的配制 | 第45-47页 |
| 2.1.4.3 重组杆状病毒滴度检测相关溶液的配制 | 第47页 |
| 2.1.4.4 DH5α感受态的制备 | 第47-48页 |
| 2.2 实验方法 | 第48-60页 |
| 2.2.1 重组转移载体p FastBac Dual-P1-3CD的制备与转座 | 第48-50页 |
| 2.2.1.1 重组转移载体pFastBac Dual-P1-3CD的提取 | 第48页 |
| 2.2.1.2 重组转移载体pFastBac Dual-P1-3CD的酶切鉴定与测序 | 第48-49页 |
| 2.2.1.3 重组转移载体pFastBac Dual-P1-3CD与杆粒DNA的转座 | 第49-50页 |
| 2.2.2 重组杆粒DNA的制备及转染 | 第50-52页 |
| 2.2.2.1 重组杆粒DNA的提取（碱裂解法） | 第50页 |
| 2.2.2.2 重组杆粒PCR鉴定 | 第50-51页 |
| 2.2.2.3 重组杆粒的转染 | 第51-52页 |
| 2.2.3 重组杆状病毒的扩增及其滴度检测 | 第52-54页 |
| 2.2.3.1 重组杆状病毒的扩增 | 第52-53页 |
| 2.2.3.2 重组杆状病毒滴度检测 | 第53-54页 |
| 2.2.4 Sf9细胞的摇瓶培养及最适培养基的筛选 | 第54-55页 |
| 2.2.4.1 Sf9细胞的复苏 | 第54页 |
| 2.2.4.2 Sf9细胞的传代与摇瓶培养 | 第54-55页 |
| 2.2.4.3 Sf9细胞最适培养基的筛选 | 第55页 |
| 2.2.5 EV71 VLPs最适表达培养基的筛选 | 第55-58页 |
| 2.2.5.1 EV71 VLPs在不同培养基中的表达 | 第55-56页 |
| 2.2.5.2 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳 | 第56页 |
| 2.2.5.3 Western blot蛋白检测 | 第56-58页 |
| 2.2.6 EV71 VLPs多因素表达条件的优化 | 第58-60页 |
| 2.2.6.1 EV71 VLPs在不同MOI和TOH条件下的表达优化 | 第58页 |
| 2.2.6.2 EV71 VLPs在不同MOI和TOH条件下的表达检测 | 第58-59页 |
| 2.2.6.3 EV71 VLPs在不同DOI、MOI、TOH条件下的优化 | 第59-60页 |
| 2.2.6.4 EV71 VLPs在不同DOI、MOI、TOH多因素条件下的检测 | 第60页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第60-76页 |
| 2.3.1 EV71重组转移载体pFastBac Dual-P1-3CD的制备与鉴定 | 第60-62页 |
| 2.3.2 EV71重组杆粒的制备与鉴定 | 第62-63页 |
| 2.3.3 EV71重组杆状病毒的制备及其病毒滴度测定 | 第63-64页 |
| 2.3.4 Sf9细胞最适培养基的筛选 | 第64-67页 |
| 2.3.5 EV71重组杆状病毒最适表达培养基的筛选与鉴定 | 第67-70页 |
| 2.3.6 EV71 VLPs最适表达条件的优化与鉴定 | 第70-76页 |
| 2.4 小结 | 第76-78页 |
| 第三章 EV71 VLPs疫苗的色谱层析制备 | 第78-96页 |
| 3.1 主要实验材料与试剂 | 第78-82页 |
| 3.1.1 菌株、质粒与细胞 | 第78页 |
| 3.1.2 工具酶、试剂盒和其他试剂及材料 | 第78-79页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第79-80页 |
| 3.1.4 主要试剂的配制 | 第80-82页 |
| 3.1.4.1 细胞培养相关溶液的配制 | 第80页 |
| 3.1.4.2 蛋白纯化相关溶液的配制 | 第80-81页 |
| 3.1.4.3 蛋白检测相关溶液的配制 | 第81-82页 |
| 3.2 实验方法 | 第82-86页 |
| 3.2.1 Sf9细胞的Wave培养与EV71 VLPs的表达 | 第82页 |
| 3.2.2 EV71 VLPs疫苗的CsCl密度梯度超速离心纯化 | 第82-83页 |
| 3.2.3 EV71 VLPs疫苗的多步色谱层析纯化 | 第83-84页 |
| 3.2.4 Sf9细胞宿主蛋白和宿主DNA残余量检测 | 第84页 |
| 3.2.5 293S细胞的培养和EV71灭活疫苗的表达 | 第84-85页 |
| 3.2.6 EV71灭活疫苗的蔗糖密度梯度超速离心纯化 | 第85页 |
| 3.2.7 SDS-PAGE、Western Blot、HPLC蛋白检测 | 第85-86页 |
| 3.2.8 EV71 VLPs疫苗的透射电镜（TEM）观测 | 第86页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第86-94页 |
| 3.3.1 EV71 VLPs疫苗的Wave培养表达与检测 | 第86-87页 |
| 3.3.2 EV71 VLPs疫苗的多步色谱柱层析纯化与检测 | 第87-91页 |
| 3.3.3 EV71 VLPs疫苗的CsCl纯化与鉴定 | 第91-93页 |
| 3.3.4 EV71灭活疫苗的纯化与鉴定 | 第93-94页 |
| 3.4 小结 | 第94-96页 |
| 第四章 EV71 VLPs疫苗的表征与有效性的初步评价 | 第96-128页 |
| 4.1 主要实验材料与试剂 | 第96-100页 |
| 4.1.1 菌株、质粒、细胞与实验动物 | 第96-97页 |
| 4.1.2 工具酶、试剂盒和其他试剂及材料 | 第97-98页 |
| 4.1.3 主要仪器 | 第98-99页 |
| 4.1.4 主要试剂的配制 | 第99-100页 |
| 4.1.4.1 细胞实验相关溶液的配制 | 第99页 |
| 4.1.4.2 蛋白实验相关溶液的配制 | 第99-100页 |
| 4.2 实验方法 | 第100-109页 |
| 4.2.1 EV71 VLPs疫苗的细胞定位 | 第100-101页 |
| 4.2.1.1 细胞免疫荧光及共聚焦显微镜检测 | 第100-101页 |
| 4.2.1.2 细胞免疫组化、免疫金染色及超微电子显微镜的检测 | 第101页 |
| 4.2.2 EV71 VLPs疫苗的纯度检测 | 第101-102页 |
| 4.2.2.1 SDS-PAGE蛋白电泳（考马斯亮蓝染色/银染法染色） | 第101-102页 |
| 4.2.2.2 Western Blot蛋白检测和HPLC检测 | 第102页 |
| 4.2.3 EV71 VLPs疫苗的形态学检测 | 第102页 |
| 4.2.3.1 透射电镜（TEM）的检测 | 第102页 |
| 4.2.3.2 原子力显微镜（AFM）的检测 | 第102页 |
| 4.2.4 动态光散射（DLS）检测 | 第102-103页 |
| 4.2.5 低温冷冻透射电镜（Cryo-TEM）检测 | 第103页 |
| 4.2.6 分析型超速离心机（AUC）检测 | 第103页 |
| 4.2.7 质谱检测EV71 VLPs | 第103-105页 |
| 4.2.7.1 样品的制备 | 第103-104页 |
| 4.2.7.2 蛋白质N/C端测序，蛋白质序列的检测、糖基化位点的测定 | 第104页 |
| 4.2.7.3 分子量检测 | 第104-105页 |
| 4.2.7.4 等电点PI检测 | 第105页 |
| 4.2.8 EV71 VLPs与 22A12mAb抗原亲和力测定 | 第105-106页 |
| 4.2.9 EV71 C4假病毒的制备和EV71 VLPs疫苗免疫原性的测定 | 第106-108页 |
| 4.2.9.1 EV71假病毒的包装 | 第106页 |
| 4.2.9.2 EV71假病毒感染性的测定 | 第106-107页 |
| 4.2.9.3 BALB/c小鼠的免疫与血清收集 | 第107页 |
| 4.2.9.4 基于EV71 C4假病毒系统的中和抗体滴度检测 | 第107-108页 |
| 4.2.10 EV71 VLPs疫苗稳定性的检测 | 第108-109页 |
| 4.2.10.1 TEM和HPLC检测EV71 VLPs疫苗的稳定性 | 第108-109页 |
| 4.2.10.2 中和抗体滴度评价EV71 VLPs疫苗的稳定性 | 第109页 |
| 4.2.11 EV71 VLPs疫苗诱生抗体的被动保护力检测 | 第109页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第109-126页 |
| 4.3.1 EV71 VLPs的细胞定位 | 第109-112页 |
| 4.3.2 多步色谱层析EV71 VLPs纯度的检测 | 第112-114页 |
| 4.3.3 EV71 VLPs疫苗形态学和平均流体直径的检测 | 第114-115页 |
| 4.3.4 EV71 VLPs疫苗的Cryo-TEM和AUC检测 | 第115-117页 |
| 4.3.5 EV71 VLPs疫苗的质谱检测 | 第117-119页 |
| 4.3.6 EV71 VLPs疫苗与 22A12 mAb抗原亲和力的检测 | 第119-120页 |
| 4.3.7 EV71 C4假病毒系统检测EV71 VLPs疫苗的中和抗体滴度 | 第120-122页 |
| 4.3.8 EV71 VLPs疫苗稳定性的检测 | 第122-124页 |
| 4.3.9 EV71 VLPs疫苗诱生抗体的被动保护力评价 | 第124-126页 |
| 4.4 小结 | 第126-128页 |
| 讨论 | 第128-136页 |
| 结论 | 第136-138页 |
| 参考文献 | 第138-154页 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 | 第154-156页 |
| 致谢 | 第156-157页 |
