| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-36页 |
| 1 壳寡糖概述 | 第16-19页 |
| 1.1 壳寡糖的来源及功能 | 第16-18页 |
| 1.2 壳寡糖的制备 | 第18-19页 |
| 2 壳聚糖酶概述 | 第19-23页 |
| 2.1 壳聚糖酶的来源 | 第19-20页 |
| 2.2 壳聚糖酶的分类 | 第20-21页 |
| 2.3 壳聚糖酶基因的获得及体外异源表达系统构建 | 第21-22页 |
| 2.4 壳聚糖酶的性质 | 第22页 |
| 2.5 壳聚糖巧的生物学功能及应用 | 第22-23页 |
| 3 蛋白质X-射线晶体学概述 | 第23-29页 |
| 3.1 蛋白质结构的测定方法 | 第23-24页 |
| 3.2 蛋白质X-射线晶体学概述 | 第24-29页 |
| 4 壳聚糖酶的三维空间结构简介 | 第29-30页 |
| 5 GH46壳聚糖酶研究现状 | 第30-35页 |
| 5.1 壳聚糖酶的催化机理 | 第31-32页 |
| 5.2 壳聚糖酶水解过程及产物分析 | 第32-33页 |
| 5.3 壳聚糖酶中与催化相关的氨基酸功能研究 | 第33-35页 |
| 6 选题背景和研究意义 | 第35-36页 |
| 第二章 Chitosanase OU01在大肠杆菌中的重组表达及酶的分离纯化 | 第36-52页 |
| 第一节 Chitosanse OU01基因克隆及表达载体的构建 | 第36-46页 |
| 1 材料与试剂 | 第36-37页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第36-37页 |
| 1.2 试剂 | 第37页 |
| 2 实验方法 | 第37-42页 |
| 2.1 细菌基因组提取 | 第37-38页 |
| 2.2 引物设计 | 第38-39页 |
| 2.3 PCR扩增及产物回收 | 第39-40页 |
| 2.4 目的片段及表达载体的双酶切处理 | 第40页 |
| 2.5 目的片段与表达载体连接 | 第40-41页 |
| 2.6 转化E.coli DH5α感受态细胞 | 第41页 |
| 2.7 表达菌株的构建 | 第41-42页 |
| 3 实验结果 | 第42-45页 |
| 3.1 Chitosanse OU01基因的克隆 | 第42-43页 |
| 3.2 目的基因与表达载体双酶切结果 | 第43-44页 |
| 3.3 重组表达菌株的构建 | 第44-45页 |
| 4 讨论 | 第45页 |
| 5 小结 | 第45-46页 |
| 第二节 Chitosanse OU01在大肠杆菌中的表达及重组蛋白的分离纯化 | 第46-52页 |
| 1 材料试剂与主要仪器设备 | 第46页 |
| 2 实验方法 | 第46-48页 |
| 2.1 重组蛋白的诱导表达 | 第46-47页 |
| 2.2 菌体破碎 | 第47页 |
| 2.3 亲和层析及柱上酶切 | 第47页 |
| 2.4 凝胶过滤层析 | 第47-48页 |
| 3 实验结果 | 第48-50页 |
| 3.1 重组蛋白的表达 | 第48页 |
| 3.2 亲和层析及柱上酶切对chitosanase OU01的纯化 | 第48页 |
| 3.3 凝胶过滤层析纯化结果 | 第48-50页 |
| 4 讨论 | 第50-51页 |
| 5 小结 | 第51-52页 |
| 第三章 Chitosanase OU01动力学参数测定、酶解产物及酶动力学分析 | 第52-62页 |
| 1 实验试剂与主要仪器 | 第52-53页 |
| 2 实验方法 | 第53-55页 |
| 2.1 DNS标准曲线的制作 | 第53页 |
| 2.2 蛋白质浓度的测定 | 第53-54页 |
| 2.3 壳聚糖酶活力的测定 | 第54页 |
| 2.4 Chitosanase OU01动力学常数的测定 | 第54页 |
| 2.5 Chitosanase OU01水解产物分析 | 第54-55页 |
| 2.6 Chitosanase OU01水解动力学研究 | 第55页 |
| 3 实验结果 | 第55-59页 |
| 3.1 Chitosanase OU01的米氏常数 | 第55-56页 |
| 3.2 水解产物的质谱分析 | 第56-57页 |
| 3.3 水解产物的TLC分析结果 | 第57-58页 |
| 3.4 不同时间点水解样品的NMR分析 | 第58-59页 |
| 3.5 水解曲线 | 第59页 |
| 4 讨论 | 第59-61页 |
| 5 小结 | 第61-62页 |
| 第四章 Chitosanase OU01-(GlcN)_6复合物晶体的培养与结构解析 | 第62-78页 |
| 1 实验试剂与主要仪器 | 第62页 |
| 2 实验方法 | 第62-66页 |
| 2.1 催化关键氨基酸的确定 | 第62-63页 |
| 2.2 关键氨基酸的定点突变 | 第63-64页 |
| 2.3 突变体蛋白的表达与分离纯化 | 第64页 |
| 2.4 突变体E25A与D43A活性测定 | 第64页 |
| 2.5 酶与底物复合物晶体的生长与筛选 | 第64-65页 |
| 2.6 晶体数据的收集 | 第65-66页 |
| 2.7 晶体结构解析 | 第66页 |
| 3 实验结果 | 第66-75页 |
| 3.1 催化关键氨基酸的确定 | 第66-67页 |
| 3.2 氨基酸定点突变 | 第67页 |
| 3.3 突变体活性 | 第67页 |
| 3.4 酶与底物复合物的形成 | 第67-68页 |
| 3.5 晶体生长条件筛选 | 第68页 |
| 3.6 复合物晶体衍射数据收集及结构解析 | 第68-71页 |
| 3.7 复合物晶体的整体结构描述 | 第71-73页 |
| 3.8 六糖底物的电子密度图 | 第73-74页 |
| 3.9 Chitosanase OU01空间结构比较 | 第74-75页 |
| 4 讨论 | 第75-77页 |
| 5 小结 | 第77-78页 |
| 第五章 基于复合物结构的底物结合特异性及催化机理研究 | 第78-103页 |
| 第一节 Chitosanase OU01结合口袋内部酶与底物的相互作用分析 | 第78-87页 |
| 1 实验试剂与主要仪器 | 第78页 |
| 2 实验方法 | 第78-81页 |
| 2.1 结合口袋内酶与底物相互作用分析 | 第78页 |
| 2.2 突变体的制备 | 第78-79页 |
| 2.3 酶活性测定 | 第79页 |
| 2.4 酶的热稳定性实验 | 第79-81页 |
| 3 实验结果 | 第81-85页 |
| 3.1 结合口袋内部酶与底物形成的相互作用 | 第81-83页 |
| 3.2 突变体活性测定 | 第83页 |
| 3.3 各个突变体蛋白质构象的变化研究(DSF) | 第83-85页 |
| 4 讨论 | 第85-86页 |
| 5 小结 | 第86-87页 |
| 第二节 Chitosanase OU01的催化机理研究 | 第87-92页 |
| 1 实验方法 | 第87页 |
| 2 实验结果 | 第87-89页 |
| 2.1 E25A复合物结构中催化关键作用的分析 | 第87-88页 |
| 2.2 D43A复合物结构中催化关键作用的分析 | 第88-89页 |
| 3 讨论 | 第89-91页 |
| 4 小结 | 第91-92页 |
| 第三节 Chitosanase OU01酶切位点底物结合特异性分析 | 第92-103页 |
| 1 实验试剂 | 第92页 |
| 2 实验方法 | 第92-94页 |
| 2.1 水解DDA=50%壳聚糖 | 第92页 |
| 2.2 水解产物的质谱分析 | 第92-93页 |
| 2.3 水解产物的甲基化处理 | 第93页 |
| 2.4 二级质谱分析 | 第93页 |
| 2.5 分子对接 | 第93-94页 |
| 3 实验结果 | 第94-98页 |
| 3.1 水解DDA=50%壳聚糖 | 第94页 |
| 3.2 水解产物质谱分析 | 第94-95页 |
| 3.3 水解产物的甲基化及质谱分析 | 第95页 |
| 3.4 水解产物的结构分析 | 第95-97页 |
| 3.5 分子对接 | 第97-98页 |
| 4 讨论 | 第98-102页 |
| 5 小结 | 第102-103页 |
| 第六章 壳聚糖酶与底物复合物的形成机理 | 第103-119页 |
| 1 实验方法 | 第103-105页 |
| 1.1 结合口袋外部底物结合位点预测 | 第103页 |
| 1.2 预测氨基酸功能的验证 | 第103-104页 |
| 1.3 突变体D40A的酶热稳定分析 | 第104页 |
| 1.4 小分子底物的制备及组分鉴定 | 第104页 |
| 1.5 突变体对小分子底物的活性测定 | 第104-105页 |
| 1.6 由底物结合引起的酶构象变化分析 | 第105页 |
| 2 实验结果 | 第105-112页 |
| 2.1 复合物结构表面电荷分析及底物结合位点预测 | 第105-106页 |
| 2.2 预测氨基酸突变体的相对酶活性 | 第106-107页 |
| 2.3 突变体D40A热稳定性分析 | 第107页 |
| 2.4 小分子底物的制备 | 第107-108页 |
| 2.5 突变体对小分子底物的相对活性 | 第108-109页 |
| 2.6 底物结合引起的酶构象变化分析 | 第109-112页 |
| 3 讨论 | 第112-118页 |
| 4 小结 | 第118-119页 |
| 全文总结 | 第119-121页 |
| 论文创新点 | 第121页 |
| 论文不足及下一步研究计划 | 第121-122页 |
| 参考文献 | 第122-131页 |
| 致谢 | 第131-132页 |
| 个人简历 | 第132-133页 |
| 发表的学术论文 | 第133页 |
