| 本研究工作的主要创新点 | 第5-12页 |
| 摘要 | 第12-15页 |
| ABSTRACT | 第15-18页 |
| 第一章 绪论 | 第19-72页 |
| 1.1 乙酰辅酶A在微生物体内的代谢 | 第19-28页 |
| 1.1.1 乙酰辅酶A在原核生物中的代谢与调控 | 第19-22页 |
| 1.1.1.1 从丙酮酸合成乙酰辅酶A | 第19-20页 |
| 1.1.1.2 从乙酸合成乙酰辅酶A | 第20页 |
| 1.1.1.3 从脂肪酸合成乙酰辅酶A | 第20-21页 |
| 1.1.1.4 乙酰辅酶A用于TCA循环 | 第21页 |
| 1.1.1.5 乙酰辅酶A用于合成乙酸和乙醇 | 第21页 |
| 1.1.1.6 乙酰辅酶A用于乙醛酸循环 | 第21页 |
| 1.1.1.7 乙酰辅酶A用于脂肪酸合成 | 第21-22页 |
| 1.1.2 乙酰辅酶A在真核生物中的代谢与调控 | 第22-25页 |
| 1.1.2.1 乙酰辅酶A的中心碳代谢 | 第23页 |
| 1.1.2.2 乙酰辅酶A与脂肪酸和甾醇的代谢 | 第23-24页 |
| 1.1.2.3 乙酰辅酶A在不同细胞器中的运输 | 第24页 |
| 1.1.2.4 乙酰辅酶A与蛋白乙酰化 | 第24-25页 |
| 1.1.3 工程酿酒酵母乙酰辅酶A代谢 | 第25-28页 |
| 1.1.3.1 工程PDH旁路途径 | 第26-27页 |
| 1.1.3.2 工程PK途径 | 第27页 |
| 1.1.3.3 工程其他外源途径 | 第27-28页 |
| 1.2 乙酰辅酶A衍生的产品 | 第28-30页 |
| 1.3 代谢工程 | 第30-36页 |
| 1.3.1 传统代谢工程 | 第30-33页 |
| 1.3.1.1 过表达关键基因,增加目标通路代谢流 | 第31-32页 |
| 1.3.1.2 阻断旁路途径或者降解途径 | 第32页 |
| 1.3.1.3 解除代谢调控 | 第32-33页 |
| 1.3.1.4 随机突变、定向进化与高通量筛选 | 第33页 |
| 1.3.2 系统代谢工程 | 第33-34页 |
| 1.3.3 逆向代谢工程 | 第34-36页 |
| 1.4 合成生物学 | 第36-48页 |
| 1.4.1 合成生物学概念 | 第36页 |
| 1.4.2 基本元件的构建 | 第36-37页 |
| 1.4.3 基因线路 | 第37-38页 |
| 1.4.4 基因组编辑 | 第38-39页 |
| 1.4.5 合成生物学的应用 | 第39-48页 |
| 1.4.5.1 正丁醇和异丁醇 | 第40-41页 |
| 1.4.5.2 紫杉醇 | 第41-42页 |
| 1.4.5.3 青蒿素 | 第42-44页 |
| 1.4.5.4 脂肪酸酯 | 第44-45页 |
| 1.4.5.5 鸦片类药物 | 第45-46页 |
| 1.4.5.6 非天然蛋白质 | 第46-47页 |
| 1.4.5.7 人工生命体 | 第47-48页 |
| 1.5 靶向代谢工程的应用 | 第48-51页 |
| 1.6 3羟基丙酸合成的研究进展 | 第51-54页 |
| 1.6.1 3羟基丙酸合成途径 | 第51-53页 |
| 1.6.2 微生物合成3羟基丙酸的研究进展 | 第53-54页 |
| 1.6.2.1 以甘油为碳源合成3羟基丙酸 | 第53-54页 |
| 1.6.2.2 以葡萄糖为碳源合成3羟基丙酸 | 第54页 |
| 1.7 脂肪酸合成途径代谢改造研究进展 | 第54-63页 |
| 1.7.1 脂肪酸合成途径的反应机理 | 第55-56页 |
| 1.7.2 提高自由脂肪酸产量的研究进展 | 第56-58页 |
| 1.7.3 合成脂肪酸衍生物的研究进展 | 第58-63页 |
| 1.7.3.1 脂肪酸酯 | 第58-60页 |
| 1.7.3.2 脂肪醇 | 第60-61页 |
| 1.7.3.3 脂肪烷烃 | 第61-62页 |
| 1.7.3.4 聚羟基脂肪酸脂(PHA) | 第62-63页 |
| 1.8 萜类化合物研究进展 | 第63-70页 |
| 1.8.1 萜类化合物简介 | 第63-65页 |
| 1.8.2 萜类化合物合成机理 | 第65-66页 |
| 1.8.3 利用微生物生产萜类化合物的研究进展 | 第66-67页 |
| 1.8.4 利用微生物生产类胡萝卜素的研究进展 | 第67-70页 |
| 1.8.4.1 类胡萝卜素简介 | 第67-68页 |
| 1.8.4.2 类胡萝卜素合成进展 | 第68-70页 |
| 1.9 本课题的研究意义和主要内容 | 第70-72页 |
| 1.9.1 本课题的研究意义 | 第70页 |
| 1.9.2 本课题的主要内容 | 第70-72页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第72-98页 |
| 2.1 培养基 | 第72-74页 |
| 2.1.1 大肠杆菌常用培养基 | 第72-73页 |
| 2.1.2 酿酒酵母常用培养基 | 第73-74页 |
| 2.1.3 毕赤酵母和解脂耶氏酵母常用培养基 | 第74页 |
| 2.2 试剂 | 第74-77页 |
| 2.3 实验方法 | 第77-98页 |
| 2.3.1 大肠杆菌的活化培养 | 第77-78页 |
| 2.3.2 大肠杆菌的保存 | 第78页 |
| 2.3.3 酿酒酵母的活化培养 | 第78页 |
| 2.3.4 酿酒酵母保存 | 第78页 |
| 2.3.5 大肠杆菌基因组总DNA的提取 | 第78-79页 |
| 2.3.6 酵母基因组DNA的提取 | 第79-80页 |
| 2.3.7 小量PCR产物的纯化(QIAGEN试剂盒) | 第80页 |
| 2.3.8 凝胶回收DNA片段(QIAGEN试剂盒) | 第80-81页 |
| 2.3.9 DNA的酶切 | 第81页 |
| 2.3.10 DNA的酶连反应 | 第81-82页 |
| 2.3.11 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第82页 |
| 2.3.12 质粒DNA对大肠杆菌感受态细胞的转化 | 第82-83页 |
| 2.3.13 连接产物对大肠杆菌感受态细胞的转化 | 第83页 |
| 2.3.14 酿酒酵母LiAc转化 | 第83-84页 |
| 2.3.15 毕赤酵母电转化 | 第84-85页 |
| 2.3.16 解脂耶氏酵母LiAc转化 | 第85页 |
| 2.3.17 大肠杆菌质粒DNA的少量提取(Axygen试剂盒) | 第85-86页 |
| 2.3.18 大肠杆菌质粒DNA的大量提取 | 第86-87页 |
| 2.3.19 酿酒酵母质粒DNA的少量提取(天根试剂盒) | 第87-88页 |
| 2.3.20 大肠杆菌中构建质粒DNA的快速检测 | 第88页 |
| 2.3.21 酶切验证构建的质粒DNA | 第88页 |
| 2.3.22 Simple Cloning方法组装载体 | 第88-89页 |
| 2.3.23 Gibson方法组装载体 | 第89-90页 |
| 2.3.24 DNA assemble方法在酿酒酵母体内组装载体 | 第90页 |
| 2.3.25 大肠杆菌组氨酸标签重组蛋白的诱导表达 | 第90-91页 |
| 2.3.26 大肠杆菌组氨酸标签重组蛋白的纯化 | 第91页 |
| 2.3.27 酿酒酵母蛋白的诱导表达 | 第91-92页 |
| 2.3.28 酿酒酵母生物素蛋白的纯化 | 第92-93页 |
| 2.3.29 BCA法测定蛋白浓度 | 第93页 |
| 2.3.30 Western Blot鉴定蛋白表达 | 第93-94页 |
| 2.3.31 酿酒酵母工程菌中间代谢产物的相对定量分析 | 第94-95页 |
| 2.3.31.1 脂肪酸代谢的中间产物分析 | 第94-95页 |
| 2.3.31.2 beta-胡萝卜素代谢的中间产物分析 | 第95页 |
| 2.3.32 酿酒酵母摇瓶积累脂肪酸的定量分析 | 第95-96页 |
| 2.3.32.1 酿酒酵母产脂肪酸样品的准备 | 第95-96页 |
| 2.3.32.2 酿酒酵母产脂肪酸样品的GC-MS定量分析 | 第96页 |
| 2.3.33 酿酒酵母摇瓶积累beta-胡萝卜素定量分析 | 第96-97页 |
| 2.3.33.1 酿酒酵母产beta-胡萝卜素样品的准备 | 第96页 |
| 2.3.33.2 酿酒酵母产beta-胡萝卜素样品的HPLC分析 | 第96-97页 |
| 2.3.34 大肠杆菌和酿酒酵母摇瓶培养产3羟基丙酸分析 | 第97-98页 |
| 2.3.34.1 3羟基丙酸样品的HPLC分析 | 第97页 |
| 2.3.34.2 胞外代谢产物的HPLC分析 | 第97-98页 |
| 第三章 工程Metallosphaera sedula来源的3羟基丙酸/4羟基丁酸循环途径合成 | 第98-123页 |
| 3.1 引言 | 第98-100页 |
| 3.2 实验材料 | 第100-107页 |
| 3.2.1 质粒 | 第100-102页 |
| 3.2.2 菌株 | 第102-103页 |
| 3.2.3 引物 | 第103-107页 |
| 3.3 结果与分析 | 第107-120页 |
| 3.3.1 3羟基丙酸体外体系的建立 | 第107-109页 |
| 3.3.2 3羟基丙酸系统中各个蛋白的稳态动力学分析 | 第109-111页 |
| 3.3.3 体外分析3羟基丙酸和脂肪酸合成的竞争 | 第111-113页 |
| 3.3.4 评估不同的底盘细胞用于合成3羟基丙酸 | 第113-116页 |
| 3.3.5 体内调节MCR的表达水平 | 第116-118页 |
| 3.3.6 提高前体和辅因子的供应 | 第118-119页 |
| 3.3.7 抑制脂肪酸途径提高3羟基丙酸合成 | 第119-120页 |
| 3.4 小结与讨论 | 第120-123页 |
| 第四章 工程改造酿酒酵母提高脂肪酸合成 | 第123-146页 |
| 4.1 引言 | 第123-125页 |
| 4.2 实验材料 | 第125-128页 |
| 4.2.1 质粒 | 第125-126页 |
| 4.2.2 菌株 | 第126-127页 |
| 4.2.3 引物 | 第127-128页 |
| 4.3 结果与分析 | 第128-144页 |
| 4.3.1 阻断脂肪酸降解提高体内脂肪酸的积累 | 第128-131页 |
| 4.3.2 超表达限速步骤提高脂肪酸的积累 | 第131-133页 |
| 4.3.3 阻断副产物乙醇的合成提高脂肪酸的积累 | 第133-135页 |
| 4.3.4 摇瓶培养测试工程菌的发酵性能 | 第135-137页 |
| 4.3.5 体外鉴定脂肪酸合成的瓶颈 | 第137-140页 |
| 4.3.6 质谱分析ACC蛋白的磷酸化修饰位点 | 第140-144页 |
| 4.4 小结与讨论 | 第144-146页 |
| 第五章 酿酒酵母中构建高效生物合成途径生产beta-胡萝卜素 | 第146-167页 |
| 5.1 引言 | 第146-148页 |
| 5.2 实验材料与方法 | 第148-154页 |
| 5.2.1 质粒 | 第148-149页 |
| 5.2.2 菌株 | 第149-150页 |
| 5.2.3 引物 | 第150-154页 |
| 5.3 结果与分析 | 第154-165页 |
| 5.3.1 半乳糖诱导启动子的特征性比较 | 第154-156页 |
| 5.3.1.1 半乳糖诱导启动子的选择 | 第154-155页 |
| 5.3.1.2 背景菌株的构建 | 第155页 |
| 5.3.1.3 半乳糖诱导启动子的强度比较 | 第155-156页 |
| 5.3.2 beta-胡萝卜素菌株的构建 | 第156-160页 |
| 5.3.2.1 构建MVA代谢途径表达载体 | 第156-158页 |
| 5.3.2.2 beta-胡萝卜素合成相关载体的构建 | 第158-159页 |
| 5.3.2.3 beta-胡萝卜素工程菌的构建 | 第159-160页 |
| 5.3.3 beta-胡萝卜素工程菌的摇瓶发酵 | 第160-161页 |
| 5.3.4 不同培养基对菌株合成beta-胡萝卜素的影响 | 第161-162页 |
| 5.3.5 beta-胡萝卜素工程菌的中间代谢产物分析 | 第162-163页 |
| 5.3.6 平衡beta-胡罗卜素合成途径 | 第163-165页 |
| 5.4 本章小结与展望 | 第165-167页 |
| 第六章 总结与展望 | 第167-169页 |
| 6.1 本研究工作总结 | 第167-168页 |
| 6.2 本研究工作的进一步展望 | 第168-169页 |
| 参考文献 | 第169-189页 |
| 附录 | 第189-199页 |
| 攻博期间发表的与学位论文相关的科研成果 | 第199-200页 |
| 致谢 | 第200-201页 |
