| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 缩略词表 | 第14-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-34页 |
| 1 动物克隆与体细胞克隆发展简介 | 第16-22页 |
| 1.1 动物克隆发展历史的回顾 | 第17-19页 |
| 1.2 体细胞克隆的发展和应用前景 | 第19-22页 |
| 1.2.1 体细胞克隆的发展 | 第19-20页 |
| 1.2.2 体细胞克隆的应用前景 | 第20-22页 |
| 2 克隆猪和转基因猪的研究 | 第22-25页 |
| 2.1 克隆猪和转基因猪的研究 | 第22-24页 |
| 2.2 SCNT和CRISPR/Cas9基因组编辑技术结合在生产转基因猪的应用 | 第24-25页 |
| 3 SCNT存在的问题，原因与解决方案 | 第25-31页 |
| 3.1 SCNT存在的问题 | 第25-26页 |
| 3.2 克隆效率低的原因 | 第26-27页 |
| 3.3 表观重塑是解决克隆效率低的有效方案 | 第27-31页 |
| 3.3.1 组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA的应用 | 第28-29页 |
| 3.3.2 组蛋白去乙酰化抑制剂在SCNT中的应用 | 第29-30页 |
| 3.3.3 提高克隆效率的有效方案 | 第30-31页 |
| 4 组蛋白去乙酰化酶抑制剂Oxamflatin的简介与应用 | 第31-33页 |
| 4.1 不同类型的组蛋白去乙酰化酶抑制剂 | 第31-32页 |
| 4.2 组蛋白去乙酰化酶抑制剂的功能 | 第32页 |
| 4.3 去乙酰化酶抑制剂Oxamflatin及其研究现状 | 第32-33页 |
| 5 研究的目的与意义 | 第33-34页 |
| 第二章 材料与方法 | 第34-59页 |
| 1 实验材料 | 第34-40页 |
| 1.1 实验样品 | 第34页 |
| 1.2 主要仪器设备 | 第34-35页 |
| 1.3 主要试剂与试剂盒 | 第35-37页 |
| 1.4 常用化学试剂、培养液及其配制 | 第37-40页 |
| 1.5 主要分子生物学软件及数据库 | 第40页 |
| 2 实验方法 | 第40-59页 |
| 2.1 猪胎儿成纤维细胞系的建立与培养 | 第40-42页 |
| 2.1.1 猪胎儿成纤维细胞系的建立 | 第40-41页 |
| 2.1.2 猪胎儿成纤维细胞的传代 | 第41页 |
| 2.1.3 猪胎儿成纤维细胞的冷冻 | 第41-42页 |
| 2.2 利用体细胞核移植获得猪克隆胚胎 | 第42-47页 |
| 2.2.1 洗卵液和成熟培养液的准备 | 第42页 |
| 2.2.2 卵巢的收集与运输 | 第42页 |
| 2.2.3 抽吸卵泡 | 第42-43页 |
| 2.2.4 捡卵 | 第43-44页 |
| 2.2.5 挑捡成熟的卵母细胞 | 第44页 |
| 2.2.6 显微操作 | 第44-46页 |
| 2.2.7 重构胚胎融合与激活 | 第46页 |
| 2.2.8 重构胚胎的培养 | 第46-47页 |
| 2.3 Oxamflatin准备与处理 | 第47页 |
| 2.3.1 Oxamflatin处理猪克隆胚胎 | 第47页 |
| 2.3.2 Oxamflatin处理猪胎儿成纤维细胞 | 第47页 |
| 2.4 组蛋白去乙酰化酶活性检测 | 第47-48页 |
| 2.5 胚胎和细胞免疫荧光 | 第48-49页 |
| 2.5.1 胚胎免疫荧光染色 | 第48-49页 |
| 2.5.2 胚胎免疫荧光共染 5mC和 5hmC | 第49页 |
| 2.5.3 细胞免疫荧光染色 | 第49页 |
| 2.6 RNA的提取和基因表达定量分析 | 第49-52页 |
| 2.6.1 总RNA的提取 | 第49-51页 |
| 2.6.2 RNA的反转录 | 第51页 |
| 2.6.3 定量引物设计与评价 | 第51-52页 |
| 2.6.4 荧光定量PCR | 第52页 |
| 2.7 DNA甲基化分析 | 第52-56页 |
| 2.7.1 胚胎DNA的处理 | 第52-53页 |
| 2.7.2 PCR扩增 | 第53-54页 |
| 2.7.3 PCR产物的回收 | 第54-55页 |
| 2.7.4 目的片段与T载体连接 | 第55页 |
| 2.7.5 阳性菌落的筛选与测序 | 第55页 |
| 2.7.6 甲基化结果分析 | 第55-56页 |
| 2.8 MTT检测细胞存活和生长 | 第56页 |
| 2.9 细胞总蛋白的提取与Western blot免疫印迹 | 第56-58页 |
| 2.9.1 细胞总蛋白的提取 | 第56-57页 |
| 2.9.2 Western blot免疫印迹 | 第57-58页 |
| 2.10 数据统计分析方法 | 第58-59页 |
| 第三章 结果与分析 | 第59-81页 |
| 1 Oxamflatin处理对猪克隆胚胎体外发育率的影响 | 第59-74页 |
| 1.1 Oxamflatin处理猪重构胚胎的预实验 | 第59页 |
| 1.2 优化Oxamflatin处理猪重构胚胎的条件 | 第59-61页 |
| 1.3 Oxamflatin处理降低了猪克隆胚胎总的组蛋白去乙酰化酶活性 | 第61页 |
| 1.4 Oxamflatin处理提高了猪体细胞克隆胚胎组蛋白乙酰化水平通过下调HDAC1的表达 | 第61-65页 |
| 1.4.1 Oxamflatin处理提高了猪体细胞克隆胚胎组蛋白乙酰化水平 | 第61-63页 |
| 1.4.2 Oxamflatin处理导致猪克隆胚胎HDAC1基因表达的下调 | 第63-65页 |
| 1.5 Oxamflatin处理诱导了猪SCNT胚胎在第一次和第二次有丝分裂细胞周期过程中非组蛋白 α-tubulin的乙酰化水平的升高 | 第65-70页 |
| 1.6 Oxamflatin处理对猪SCNT胚胎总DNA甲基化和羟甲基化水平的影响 | 第70-72页 |
| 1.6.1 Oxamflatin处理降低了二细胞阶段猪SCNT胚胎的总DNA甲基化和羟甲基化的水平 | 第70-71页 |
| 1.6.2 Oxamflatin处理降低了二细胞阶段猪SCNT胚胎DNMT1的表达 | 第71-72页 |
| 1.7 Oxamflatin处理对猪SCNT胚胎多潜能相关基因表达的影响 | 第72-73页 |
| 1.8 Oxamflatin处理对区域特异性的DNA甲基化水平的影响 | 第73-74页 |
| 2 Oxamflatin处理对猪胎儿成纤维细胞的影响 | 第74-81页 |
| 2.1 Oxamflatin处理对猪胎儿成纤维细胞生长与存活的影响 | 第74-75页 |
| 2.2 Oxamflatin处理对猪胎儿成纤维细胞组蛋白乙酰化水平的影响 | 第75-77页 |
| 2.3 Oxamflatin处理对猪胎儿成纤维细胞 α-tubulin乙酰化水平的影响 | 第77-78页 |
| 2.4 Oxamflatin处理对猪胎儿成纤维细胞总的 5-mC和 5-hmC水平的影响 | 第78-79页 |
| 2.5 Oxamflatin预处理猪胎儿成纤维细胞降低了猪体细胞克隆胚胎体外发育率 | 第79-81页 |
| 第四章 讨论 | 第81-85页 |
| 1 关于组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理对克隆胚胎发育率的影响 | 第81-82页 |
| 2 关于Oxamflatin对非组蛋白 α-tubulin乙酰化水平的调节 | 第82-83页 |
| 3 关于Oxamflatin对DNA甲基化水平的调节 | 第83-84页 |
| 4 关于Oxamflatin对多潜能基因表达的调控 | 第84页 |
| 5 关于卫星DNA重复序列甲基化水平的调节 | 第84-85页 |
| 第五章 结论 | 第85-88页 |
| 1 主要研究结果 | 第85-86页 |
| 2 不足之处 | 第86页 |
| 3 下一步工作计划 | 第86-88页 |
| 参考文献 | 第88-106页 |
| 附录 | 第106-108页 |
| 在读期间发表论文列表 | 第108-109页 |
| 致谢 | 第109-111页 |
