| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 英文缩略词 | 第7-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-28页 |
| ·纤维素与纤维素酶 | 第11-18页 |
| ·纤维素酶的催化机制 | 第12-13页 |
| ·纤维素酶的分类和结构 | 第13-15页 |
| ·纤维素酶的应用 | 第15-16页 |
| ·纤维素酶定向进化 | 第16-18页 |
| ·Pichia pastoris 表达系统 | 第18-19页 |
| ·酵母表达系统的特点 | 第18页 |
| ·PAOX1 表达系统 | 第18-19页 |
| ·PGAP 表达系统 | 第19页 |
| ·课题研究基础 | 第19-25页 |
| ·家族同源分析 | 第20-22页 |
| ·重组纤维素酶设计方案 | 第22页 |
| ·重组纤维素酶结构合理性评估和计算机模拟删选 | 第22-25页 |
| ·论文的研究意义和技术路线 | 第25-28页 |
| ·本课题的研究内容 | 第25-26页 |
| ·本课题的研究意义 | 第26页 |
| ·本课题的技术路线 | 第26-28页 |
| 第二章 NtEG-E4 重组基因的人工合成及pGAPZαA-NtEG-E4 重组质粒的构建 | 第28-42页 |
| ·引言 | 第28页 |
| ·实验材料 | 第28-30页 |
| ·质粒和菌株 | 第28页 |
| ·主要试剂 | 第28页 |
| ·主要仪器 | 第28-29页 |
| ·溶液配制 | 第29-30页 |
| ·实验方法 | 第30-36页 |
| ·酵母表达载体pGAPZαA-NtEG~1-E4~1 ，pGAPZαA-NtEG~2-E4~2 ，pGAPZαA-NtEG~3-E4~3 的构建策略 | 第30页 |
| ·NtEG 催化域和E4 结合域的PCR 扩增及酶切 | 第30-32页 |
| ·重组PCR 获得完整的NtEG-E4 重组基因 | 第32-33页 |
| ·经纯化的重组PCR 产物和pGAPZαA 空载体的酶切 | 第33页 |
| ·目的片段与载体的连接 | 第33-35页 |
| ·大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 | 第35页 |
| ·重组质粒转染大肠杆菌 | 第35页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第35-36页 |
| ·结果与分析 | 第36-40页 |
| ·NtEG 催化域和E4 结合域的PCR 扩增鉴定 | 第36-37页 |
| ·重组PCR 扩增鉴定 | 第37页 |
| ·重组质粒的双酶切鉴定 | 第37-38页 |
| ·重组质粒测序结果 | 第38页 |
| ·重组质粒的物理图谱 | 第38-40页 |
| ·小结 | 第40-42页 |
| 第三章 pGAPZαA-NtEG-E4 重组质粒在毕赤酵母中的表达及催化效率的测定 | 第42-58页 |
| ·引言 | 第42页 |
| ·实验材料 | 第42-44页 |
| ·菌株 | 第42页 |
| ·主要试剂 | 第42页 |
| ·主要仪器 | 第42页 |
| ·溶液配制 | 第42-44页 |
| ·实验方法 | 第44-51页 |
| ·酵母表达系统表达重组酶的策略 | 第44页 |
| ·质粒的大量制备 | 第44-45页 |
| ·质粒的纯化 | 第45页 |
| ·重组质粒 pGAPZαA-NtEG~1-E4~1,pGAPZαA-NtEG~2-E4~2,pGAPZαA-NtEG~3-E4~3 线性化 | 第45-46页 |
| ·酶切产物的浓缩 | 第46-47页 |
| ·电转用毕赤酵母感受态的准备 | 第47页 |
| ·毕赤酵母的电转化 | 第47-48页 |
| ·酵母基因组 DNA 的提取（玻璃珠法） | 第48页 |
| ·重组毕赤酵母的 PCR 鉴定 | 第48-49页 |
| ·刚果红杯碟快速鉴定法 | 第49页 |
| ·酵母工程菌株小规模表达粗酶液的制备 | 第49页 |
| ·表达产物的酶活测定 | 第49-51页 |
| ·结果与分析 | 第51-56页 |
| ·重组毕赤酵母pGAPZαA-NtEG~1-E4~1 ，pGAPZαA-NtEG~2-E4~2 ,pGAPZαA-NtEG~3-E4~3 基因组的 PCR 鉴定 | 第51-52页 |
| ·重组体表达后的刚果红活性检测 | 第52-54页 |
| ·表达产物的酶活测定 | 第54-56页 |
| ·小结 | 第56-58页 |
| 结论与展望 | 第58-60页 |
| 参考文献 | 第60-64页 |
| 附录 | 第64-68页 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 | 第68-69页 |
| 致谢 | 第69-70页 |
| 附件 | 第70页 |
