| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第一章 前言 | 第11-27页 |
| 1.1 腺苷简介 | 第11-15页 |
| 1.1.1 腺苷的理化性质 | 第11-12页 |
| 1.1.2 腺苷生理机能 | 第12-14页 |
| 1.1.3 腺苷应用 | 第14-15页 |
| 1.2 腺苷的生产方法 | 第15-21页 |
| 1.2.1 腺苷主要的工业化生产方法及特点 | 第15-16页 |
| 1.2.2 核苷类物质在枯草芽孢杆菌内的合成途径 | 第16-18页 |
| 1.2.3 嘌呤核苷酸物质合成的调节位点和腺苷的育种方法 | 第18-21页 |
| 1.3 国内外腺苷生产菌种选育的发展状况 | 第21-22页 |
| 1.4 传统的诱变育种方法 | 第22-24页 |
| 1.5 基因敲除 | 第24页 |
| 1.6 腺苷发酵生产中存在的主要问题 | 第24-25页 |
| 1.7 本研究的立题依据和研究内容 | 第25-27页 |
| 第二章 材料与方法 | 第27-41页 |
| 2.1 实验材料 | 第27-31页 |
| 2.1.1 菌种和质粒、载体 | 第27-28页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第28-29页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第29页 |
| 2.1.4 主要溶剂 | 第29-30页 |
| 2.1.5 培养基 | 第30-31页 |
| 2.2 实验方法 | 第31-41页 |
| 2.2.1 营养缺陷型鉴定方法 | 第31-32页 |
| 2.2.2 回复突变率测定 | 第32页 |
| 2.2.3 紫外分光光度法测定发酵液中腺苷含量 | 第32-33页 |
| 2.2.4 菌种的ARTP诱变处理方法 | 第33-34页 |
| 2.2.5 诱变菌株筛选 | 第34-35页 |
| 2.2.6 突变菌株的稳定性考察 | 第35页 |
| 2.2.7 B. subtilis DI4-24R菌株DNA的制备 | 第35-36页 |
| 2.2.8 B. subtilis DI4-24R菌株hisC基因上下游DNA序列片段的合成 | 第36页 |
| 2.2.9 上下游同源臂的连接 | 第36-37页 |
| 2.2.10 构建带有下游同源臂的质粒T-H | 第37-38页 |
| 2.2.11 同源重组质粒pMAD-H的构建（采用in-fusion方法） | 第38-39页 |
| 2.2.12 B. subtilis感受态的制备方法 | 第39页 |
| 2.2.13 B. subtilis电转化方法和同源重组 | 第39-41页 |
| 第三章 结果与分析 | 第41-65页 |
| 3.1 出发菌株的分离、纯化及遗传性状鉴定 | 第41-44页 |
| 3.1.1 出发菌株的纯化 | 第41页 |
| 3.1.2 DI4-24 与DI4-24R的遗传学性状和产腺苷能力 | 第41-43页 |
| 3.1.3 DI4-24R菌株连续传代产苷稳定性的检测 | 第43-44页 |
| 3.2 B. subtilis DI4-24R的ARTP诱变育种 | 第44-53页 |
| 3.2.1 菌株B. subtilis DI4-24R生长曲线 | 第44-45页 |
| 3.2.2 ARTP诱变致死率曲线的测定 | 第45页 |
| 3.2.3 不同ARTP诱变时间效率的测定 | 第45-46页 |
| 3.2.4 ARTP诱变处理后突变株的筛选 | 第46-49页 |
| 3.2.5 诱变菌株的遗传稳定性检测 | 第49页 |
| 3.2.6 诱变菌株的产苷性能检测 | 第49-51页 |
| 3.2.7 高稳菌株AR-27 的形态观察 | 第51-52页 |
| 3.2.8 讨论 | 第52-53页 |
| 3.3 B. subtilis AR-27 菌株发酵条件优化 | 第53-57页 |
| 3.3.1 黄嘌呤、组氨酸含量对AR-27 腺苷产量的影响 | 第53-54页 |
| 3.3.2 葡萄糖含量对AR-27 腺苷产量的影响 | 第54-55页 |
| 3.3.3 有机氮源含量对AR-27 腺苷产量的影响 | 第55-56页 |
| 3.3.4 AR-27 菌株在优化培养基后的腺苷产量 | 第56-57页 |
| 3.4 DI4-24R菌株的hisC基因敲除 | 第57-65页 |
| 3.4.1 引物设计及hisC基因前后同源臂片段的合成 | 第57-59页 |
| 3.4.2 前后同源臂的连接与目的基因的构建 | 第59-61页 |
| 3.4.3 同源重组质粒pMAD-H的构建 | 第61-63页 |
| 3.4.4 将质粒pMAD-H转化至B. subtilisDI4-24R | 第63-64页 |
| 3.4.5 同源重组菌株的筛选与鉴定 | 第64页 |
| 3.4.6 讨论 | 第64-65页 |
| 第四章 结论 | 第65-67页 |
| 4.1 高产腺苷菌株DI4-24 退化的原因为组氨酸缺陷型高频率地回复突变所引起. | 第65页 |
| 4.2 ARTP诱变获得高稳产菌株AR-27 | 第65页 |
| 4.3 在优化的发酵培养基中AR-27 菌株产苷性能得到提高 | 第65页 |
| 4.4 成功构建hisC缺失的重组质粒T-H | 第65页 |
| 4.5 同源重组质粒pMAD-H的构建及B. subtilisDI4-24R（pMAD-H）转化菌株的获得 | 第65-67页 |
| 参考文献 | 第67-75页 |
| 致谢 | 第75-77页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第77-78页 |
