| 摘要 | 第1-4页 |
| ABSTRACT | 第4-6页 |
| 符号与缩略语说明 | 第6-12页 |
| 第一章 综述 | 第12-17页 |
| ·CpG佐剂与DNA疫苗 | 第12-13页 |
| ·CpG基序的作用机理及免疫学作用 | 第13-14页 |
| ·CpG结构特征与其免疫刺激特性 | 第14-15页 |
| ·核心结构 | 第14页 |
| ·侧翼序列 | 第14页 |
| ·骨架长度 | 第14-15页 |
| ·回文结构 | 第15页 |
| ·骨架结构 | 第15页 |
| ·本研究的内容、目的和意义 | 第15-17页 |
| 第二章 麻风分枝杆菌热休克蛋白HSP65的表达、纯化及小鼠多克隆抗体的制备 | 第17-30页 |
| ·材料与方法 | 第17-25页 |
| ·菌株与质粒 | 第17页 |
| ·实验试剂与仪器设备 | 第17-18页 |
| ·实验动物 | 第18页 |
| ·E.coli感受态细胞的制备 | 第18-19页 |
| ·hsp65基因的PCR扩增 | 第19页 |
| ·重组表达质粒pET28ahsp65的构建 | 第19-20页 |
| ·目的基因的诱导表达 | 第20-21页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第21-22页 |
| ·可溶性重组蛋白的纯化 | 第21-22页 |
| ·包涵体的纯化及复性 | 第22页 |
| ·Anti-Hsp65小鼠多克隆抗血清的制备 | 第22-23页 |
| ·Anti-Hsp65小鼠多克隆抗体效价的检测 | 第23-24页 |
| ·Western-blotting检测 | 第24-25页 |
| ·结果 | 第25-28页 |
| ·hsp65基因PCR扩增产物的鉴定 | 第25页 |
| ·原核重组表达质粒的构建与鉴定 | 第25-26页 |
| ·重组蛋白Hsp65表达产物的鉴定 | 第26-27页 |
| ·重组蛋白Hsp65纯化产物的鉴定 | 第27页 |
| ·Anti-Hsp65小鼠多克隆抗体的效价 | 第27页 |
| ·Western-blotting鉴定 | 第27-28页 |
| ·讨论 | 第28-30页 |
| 第三章 新型CPG基序重组质粒增强小鼠免疫效应 | 第30-51页 |
| ·材料与方法 | 第30-41页 |
| ·菌株与质粒 | 第30页 |
| ·实验试剂与仪器设备 | 第30-31页 |
| ·实验动物 | 第31页 |
| ·小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞培养 | 第31-32页 |
| ·RAW264.7细胞解冻复苏 | 第31-32页 |
| ·RAW264.7细胞培养 | 第32页 |
| ·真核表达载体pVAX1hsp65的构建 | 第32-33页 |
| ·寡聚脱氧核苷酸的设计 | 第33-34页 |
| ·真核表达载体pVAX1hsp65CpG01与pVAX1hsp65CpG02的构建 | 第34页 |
| ·重组质粒的体外瞬时转染及表达产物鉴定 | 第34-35页 |
| ·实时荧光定量PCR法检测细胞因子的表达 | 第35-36页 |
| ·RAW264.7细胞总RNA提取 | 第35页 |
| ·RT-PCR法制备cDNA | 第35-36页 |
| ·实时荧光定量PCR | 第36页 |
| ·免疫用质粒DNA的大量制备 | 第36-37页 |
| ·实验动物分组和DNA免疫 | 第37页 |
| ·间接ELISA测定血清抗体效价 | 第37-38页 |
| ·抗体分型 | 第38-39页 |
| ·小鼠脾脏分离及淋巴细胞制备 | 第39页 |
| ·IFN-γ ELISPOT | 第39-40页 |
| ·胞内细胞因子染色与流式细胞检测 | 第40页 |
| ·ELISA检测脾培养上清细胞因子 | 第40-41页 |
| ·数据作图与统计分析 | 第41页 |
| ·结果 | 第41-49页 |
| ·重组质粒构建和鉴定 | 第41-42页 |
| ·重组质粒瞬时转染人胚肾上皮细胞系293T细胞 | 第42-43页 |
| ·实时荧光定量PCR法检测细胞因子的表达 | 第43-44页 |
| ·不同重组质粒诱导的体液免疫应答分析 | 第44-46页 |
| ·不同重组质粒诱导的细胞免疫应答分析 | 第46-48页 |
| ·不同重组质粒诱导的脾淋巴细胞培养上清分泌的细胞因子 | 第48-49页 |
| ·讨论 | 第49-51页 |
| 第四章 内含子A增强HSP65的表达效率及提高DNA疫苗在小鼠中诱导的免疫原性 | 第51-62页 |
| ·材料与方法 | 第51-55页 |
| ·菌株与质粒 | 第51-52页 |
| ·实验试剂与仪器设备 | 第52页 |
| ·实验动物 | 第52页 |
| ·真核表达载体pCMV4.0hsp65与pVAX1hsp65的构建 | 第52-53页 |
| ·重组质粒的体外瞬时转染及表达产物鉴定 | 第53-54页 |
| ·免疫用质粒DNA的大量制备 | 第54页 |
| ·实验动物分组和DNA免疫 | 第54页 |
| ·ELISA检测血清抗体水平及抗体亚类 | 第54页 |
| ·小鼠脾淋巴细胞制备及IFN-γ ELISPOT测定 | 第54-55页 |
| ·胞内细胞因子染色与流式细胞检测 | 第55页 |
| ·数据作图与统计分析 | 第55页 |
| ·结果 | 第55-60页 |
| ·重组真核表达质粒的构建和酶切鉴定 | 第55-56页 |
| ·重组表达质粒体外瞬时转染及表达产物鉴定 | 第56-57页 |
| ·不同载体诱导的体液免疫应答分析 | 第57-58页 |
| ·不同载体诱导的细胞免疫应答分析 | 第58-60页 |
| ·讨论 | 第60-62页 |
| 第五章 结论与展望 | 第62-64页 |
| 参考文献 | 第64-70页 |
| 致谢 | 第70-71页 |
| 附录1 实验室常规培养基及分子生物学试剂 | 第71-73页 |
| 附录2 基因序列 | 第73-75页 |
| 附录3 载体图谱 | 第75-76页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第76页 |
