| 摘要 | 第12-15页 |
| ABSTRACT | 第15-17页 |
| 缩略语词汇表 | 第18-19页 |
| 第一章 前言 | 第19-31页 |
| 1 透明质酸 | 第19-24页 |
| 1.1 透明质酸简介 | 第19-20页 |
| 1.2 透明质酸的生物活性 | 第20-22页 |
| 1.3 HA的生物医学应用 | 第22-24页 |
| 1.4 透明质酸寡糖 | 第24页 |
| 2 透明质酸酶 | 第24-29页 |
| 2.1 透明质酸酶简介 | 第24页 |
| 2.2 透明质酸酶的分类 | 第24-25页 |
| 2.3 真核生物来源的透明质酸酶 | 第25-27页 |
| 2.4 微生物(细菌)来源的透明质酸酶 | 第27-28页 |
| 2.5 透明质酸酶的医学应用 | 第28-29页 |
| 2.6 透明质酸酶活性检测方法 | 第29页 |
| 3 立题依据 | 第29-31页 |
| 第二章 菌株基因组测序及序列分析 | 第31-39页 |
| 1 实验材料、试剂与仪器 | 第31-32页 |
| 1.1 主要试剂与仪器 | 第31-32页 |
| 1.2 数据库及分析软件 | 第32页 |
| 2 实验方法 | 第32-34页 |
| 2.1 节杆菌全基因组草图的测序 | 第32页 |
| 2.2 编码透明质酸酶核酸序列的获得 | 第32页 |
| 2.3 胞外表达谱研究 | 第32-34页 |
| 3 结果与分析 | 第34-38页 |
| 3.1 基因组测序结果分析 | 第34-35页 |
| 3.2 发酵上清液SDS-PAGE检测 | 第35-36页 |
| 3.3 发酵上清液Native-PAGE检测 | 第36-37页 |
| 3.4 质谱结果分析 | 第37-38页 |
| 4 小结 | 第38-39页 |
| 第三章 透明质酸酶活性架构生物信息学分析 | 第39-45页 |
| 1 实验材料与方法 | 第39-41页 |
| 1.1 生物信息学分析软件与网站 | 第39页 |
| 1.2 数据获取及筛选 | 第39页 |
| 1.3 序列比对与结构比对 | 第39-40页 |
| 1.4 氨基酸频率统计 | 第40页 |
| 1.5 透明质酸酶家族活性中心序列谱 | 第40-41页 |
| 2 结果与分析 | 第41-45页 |
| 2.1 GH56家族中透明质酸酶的活性架构区域 | 第41页 |
| 2.2 PL8家族中透明质酸酶的活性架构区域 | 第41-42页 |
| 2.3 透明质酸酶活性架构部位氨基酸使用频率 | 第42-43页 |
| 2.4 透明质酸酶活性架构序列谱 | 第43-45页 |
| 第四章 酶的外源表达 | 第45-59页 |
| 1 菌株与质粒 | 第45页 |
| 2 主要的仪器 | 第45页 |
| 3 主要培养基和试剂 | 第45-46页 |
| 4 实验方法 | 第46-52页 |
| 4.1 引物的设计和合成 | 第46页 |
| 4.2 重组载体的模拟构建 | 第46页 |
| 4.3 PCR获得目的基因 | 第46-48页 |
| 4.4 目的基因与载体酶切 | 第48-49页 |
| 4.5 重组扩增菌株的构建 | 第49-50页 |
| 4.6 重组质粒的酶切验证 | 第50页 |
| 4.7 重组表达菌株的构建及重组蛋白的诱导表达 | 第50-51页 |
| 4.8 目的蛋白的分离纯化 | 第51-52页 |
| 5 结果与分析 | 第52-58页 |
| 5.1 透明质酸酶基因的扩增 | 第52页 |
| 5.2 目的基因和pET-28a(+)载体的酶切 | 第52-53页 |
| 5.3 菌液PCR验证 | 第53-54页 |
| 5.4 重组质粒的酶切验证 | 第54-55页 |
| 5.5 目的基因PCR正确性验证 | 第55页 |
| 5.6 SDS-PAGE检测透明质酸酶基因的表达情况 | 第55-56页 |
| 5.7 重组透明质酸酶的纯化 | 第56-57页 |
| 5.8 重组透明质酸酶的Native-PAGE | 第57-58页 |
| 6 小结 | 第58-59页 |
| 第五章 重组透明质酸酶的酶学性质研究 | 第59-72页 |
| 1 实验材料、试剂与仪器 | 第59页 |
| 2 试验方法 | 第59-62页 |
| 2.1 相对酶活的测定 | 第59-60页 |
| 2.2 最适反应温度测定 | 第60页 |
| 2.3 重组透明质酸酶的热稳定性实验 | 第60页 |
| 2.4 最适反应pH测定 | 第60页 |
| 2.5 pH稳定性试验 | 第60页 |
| 2.6 NaH_2PO_4-Na_2HPO_4缓冲液浓度对重组透明质酸酶活力的影响 | 第60-61页 |
| 2.7 NaCl浓度对重组酶酶活的影响 | 第61页 |
| 2.8 金属离子、EDTA及表面活性剂对酶活的影响 | 第61页 |
| 2.9 底物特异性研究 | 第61页 |
| 2.10 重组透明质酸酶的酶动力学研究 | 第61-62页 |
| 3 荧光辅助糖电泳(FACE)研究重组透明质酸酶酶解产物谱 | 第62-63页 |
| 3.1 重组透明质酸酶与HA溶液的反应 | 第62页 |
| 3.2 电泳 | 第62-63页 |
| 4 结果与分析 | 第63-70页 |
| 4.1 最适反应温度及热稳定性 | 第63-64页 |
| 4.2 最适反应pH及不同pH下酶的稳定性 | 第64-66页 |
| 4.3 不同浓度的NaCl和NaH_2PO_4-Na_2HPO_4缓冲液对酶活的影响 | 第66页 |
| 4.4 金属离子、EDTA及表面活性剂对酶活的影响 | 第66-68页 |
| 4.5 重组透明质酸酶的底物特异性研究 | 第68页 |
| 4.6 重组透明质酸酶降解HA的酶动力学研究 | 第68-69页 |
| 4.7 FACE法研究重组透明质酸酶降解产物 | 第69-70页 |
| 5 小结 | 第70-72页 |
| 总结与展望 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-77页 |
| 致谢 | 第77-78页 |
| 攻读学位期间发表的论文 | 第78-79页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第79页 |
