一种基于蛋白质二级结构组合原理构建突变体文库方法的研究
| 摘要 | 第1-4页 |
| ABSTRACT | 第4-10页 |
| 引言 | 第10-11页 |
| 第一章 综述 | 第11-29页 |
| ·现代生物技术 | 第11-14页 |
| ·现代生物技术的应用 | 第11-12页 |
| ·基因工程 | 第12页 |
| ·蛋白质工程 | 第12-13页 |
| ·蛋白质工程发展历史 | 第13页 |
| ·酶的定向进化 | 第13-14页 |
| ·基因文库构建的策略 | 第14-25页 |
| ·无性突变 | 第14-18页 |
| ·易错PCR | 第14-17页 |
| ·序列饱和突变 | 第17页 |
| ·三核苷酸突变 | 第17-18页 |
| ·迭代饱和突变 | 第18页 |
| ·多元基因组工程 | 第18页 |
| ·同源性重组 | 第18-21页 |
| ·DNA改组 | 第18-19页 |
| ·基因家族改组 | 第19-20页 |
| ·交错延伸法 | 第20页 |
| ·随机引发体外重组 | 第20页 |
| ·临时模板随机嵌合技术 | 第20-21页 |
| ·随机插入-删除链交换突变 | 第21页 |
| ·串联重复插入 | 第21页 |
| ·非同源性重组 | 第21-24页 |
| ·渐进式切割产生杂合酶 | 第21-22页 |
| ·不依赖于同源性的蛋白质重组方法 | 第22-23页 |
| ·易于操作的DNA重组技术 | 第23页 |
| ·非同源随机重组技术(NRR) | 第23-24页 |
| ·基于蛋白质结构的重组 | 第24-25页 |
| ·外显子重组 | 第24页 |
| ·结构域重组 | 第24-25页 |
| ·SCHEMA技术 | 第25页 |
| ·突变体文库的筛选方法 | 第25-28页 |
| ·平板克隆筛选 | 第26页 |
| ·96孔板筛选 | 第26-27页 |
| ·噬菌体展示技术 | 第27页 |
| ·核糖体展示技术 | 第27页 |
| ·酵母细胞展示技术 | 第27-28页 |
| ·本论文研究的目的和意义 | 第28-29页 |
| 第二章 实验方案设计 | 第29-32页 |
| ·引言 | 第29页 |
| ·实验方案的设计 | 第29-30页 |
| ·实验内容的确定 | 第30-31页 |
| ·实验中需解决的关键问题 | 第31-32页 |
| 第三章 蛋白质二级结构单元的选择及确定 | 第32-37页 |
| ·引言 | 第32页 |
| ·卡那霉素抗性基因的抗性机制 | 第32-33页 |
| ·二级结构单元的选取 | 第33-36页 |
| ·Linker及引物的设计 | 第36-37页 |
| 第四章 A-T连接构建突变体文库 | 第37-55页 |
| ·引言 | 第37页 |
| ·实验仪器、试剂及溶液的配制 | 第37-39页 |
| ·实验仪器 | 第37页 |
| ·实验试剂 | 第37-38页 |
| ·溶液配制 | 第38-39页 |
| ·实验内容 | 第39-47页 |
| ·实验原理 | 第39页 |
| ·DNA双链的形成 | 第39-40页 |
| ·模块重组 | 第40-41页 |
| ·重组产物重聚及扩增 | 第41-42页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳检测 | 第42-43页 |
| ·重组产物胶回收 | 第43-44页 |
| ·质粒载体的提取 | 第44-45页 |
| ·质粒载体及目的基因的双酶切及纯化 | 第45页 |
| ·目的基因与表达载体连接 | 第45-46页 |
| ·DH5α大肠杆菌感受态细胞制备 | 第46页 |
| ·重组质粒的转化 | 第46-47页 |
| ·文库的筛选及鉴定 | 第47页 |
| ·结果与讨论 | 第47-54页 |
| ·连接条件的优化 | 第47-49页 |
| ·重聚PCR条件的优化 | 第49-50页 |
| ·胶回收目的长度区域基因及双酶切 | 第50-51页 |
| ·质粒载体提取及双酶切验证 | 第51-52页 |
| ·重组质粒转化条件优化 | 第52-53页 |
| ·突变体文库的多样性验证 | 第53-54页 |
| ·突变体文库的有效性验证 | 第54页 |
| ·小结 | 第54-55页 |
| 第五章 利用限制性核酸内切酶构建突变体文库 | 第55-63页 |
| ·引言 | 第55页 |
| ·实验仪器、试剂及溶液的配制 | 第55页 |
| ·实验步骤 | 第55-57页 |
| ·实验原理 | 第55-56页 |
| ·DNA双链的形成 | 第56页 |
| ·模块重组及扩增 | 第56-57页 |
| ·重组文库的筛选及鉴定 | 第57页 |
| ·结果与讨论 | 第57-61页 |
| ·连接条件的优化 | 第57-58页 |
| ·重聚PCR条件的优化 | 第58-60页 |
| ·突变体文库的多样性验证 | 第60页 |
| ·突变体文库的有效性验证 | 第60-61页 |
| ·小结 | 第61-63页 |
| 结论 | 第63-65页 |
| 参考文献 | 第65-71页 |
| 致谢 | 第71-72页 |
| 附录1 攻读硕士期间发表文章 | 第72-73页 |
| 附录2 测序结果 | 第73-78页 |
