| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-13页 |
| 1 前言 | 第13-21页 |
| ·猪伽马干扰素研究进展 | 第13-17页 |
| ·IFN-γ概述 | 第13页 |
| ·IFN-γ的产生 | 第13页 |
| ·pIFN-γ的特性 | 第13-14页 |
| ·IFN-γ的主要生物学活性 | 第14-15页 |
| ·受IFN-γ调控的几个重要基因 | 第15-16页 |
| ·pIFN-γ体外表达的现状 | 第16-17页 |
| ·pIFN-γ的运用前景展望 | 第17页 |
| ·毕赤酵母表达系统研究进展 | 第17-20页 |
| ·毕赤酵母表达系统概述 | 第17-18页 |
| ·毕赤酵母生物学特性 | 第18-19页 |
| ·外源基因表达的优化策略 | 第19页 |
| ·毕赤酵母表达系统展望 | 第19-20页 |
| ·本研究的意义和技术路线 | 第20-21页 |
| ·本研究的意义 | 第20页 |
| ·本研究的技术路线 | 第20-21页 |
| 2 实验材料和方法 | 第21-42页 |
| ·实验材料 | 第21-24页 |
| ·引物 | 第21-22页 |
| ·质粒与菌种 | 第22-23页 |
| ·仪器设备 | 第23页 |
| ·试剂来源 | 第23-24页 |
| ·主要试剂配方 | 第24-27页 |
| ·主要培养基 | 第24-25页 |
| ·抗生素试剂 | 第25页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳试剂 | 第25页 |
| ·质粒抽提试剂 | 第25页 |
| ·变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂 | 第25-26页 |
| ·Ni亲和层析纯化和再生试剂 | 第26页 |
| ·阳离子交换层析纯化试剂 | 第26页 |
| ·蛋白质定量试剂 | 第26页 |
| ·免疫印迹(Western-blot)检测试剂 | 第26-27页 |
| ·细胞培养试剂 | 第27页 |
| ·RNA抽提试剂 | 第27页 |
| ·试验方法 | 第27-42页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备及转化方法 | 第27-28页 |
| ·毕赤酵母感受态细胞的制备与电击转化 | 第28-29页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第29页 |
| ·普通PCR反应方法与体系 | 第29-31页 |
| ·转化子菌落PCR鉴定 | 第31页 |
| ·RT-qPCR反应体系与程序 | 第31-32页 |
| ·RNA的逆转录反应 | 第32-33页 |
| ·质粒的提取 | 第33-34页 |
| ·DNA酶切与连接 | 第34页 |
| ·变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第34-36页 |
| ·Western-blot鉴定 | 第36页 |
| ·Ni亲和层析柱树脂填料的再生 | 第36-37页 |
| ·His tag标签蛋白的Ni亲和层析 | 第37-38页 |
| ·目的蛋白的阳离子交换层析 | 第38页 |
| ·考马斯亮蓝G-250 法测定蛋白表达量 | 第38-39页 |
| ·细胞刺激实验重组蛋白样品的制备 | 第39页 |
| ·细胞培养 | 第39-41页 |
| ·重组蛋白对IPEC-J2细胞的刺激实验 | 第41-42页 |
| ·Trizol法提取IPEC-J2细胞总RNA | 第42页 |
| ·RT-qPCR结果分析 | 第42页 |
| 3 结果与分析 | 第42-70页 |
| ·pIFN-γ基因的优化 | 第42-43页 |
| ·pIFN-γ在毕赤酵母中的第一次分泌表达 | 第43-51页 |
| ·pIFN-γ与pIFN-γ-his tag基因的体外克隆 | 第43-45页 |
| ·pIFN-γ质粒保种菌大肠杆菌DH5α的构建 | 第45-46页 |
| ·pIFN-γ-his tag质粒保种菌大肠杆菌DH5α的构建 | 第46-47页 |
| ·pIFN-γ与pIFN-γ-his tag毕赤酵母分泌表达菌株的构建 | 第47-49页 |
| ·pIFN-γ毕赤酵母分泌表达菌株的构建 | 第47-48页 |
| ·pIFN-γ-his tag毕赤酵母分泌表达菌株的构建 | 第48-49页 |
| ·pIFN-γ与pIFN-γ-his tag在毕赤酵母中的分泌表达 | 第49-50页 |
| ·pIFN-γ与pIFN-γ-his tag的Western-blot检测与镍柱纯化 | 第50-51页 |
| ·pIFN-γ在毕赤酵母中的第二次分泌表达 | 第51-62页 |
| ·pIFN-γˊ与pIFN-γˊ-his tag基因的体外克隆 | 第52-54页 |
| ·pIFN-γˊ与pIFN-γˊ-his tag质粒保种菌大肠杆菌DH5α的构建 | 第54-56页 |
| ·pIFN-γ′和pIFN-γ′-his tag毕赤酵母分泌表达菌株的构建 | 第56-58页 |
| ·pIFN-γ′与pIFN-γ′-his tag在毕赤酵母中的分泌表达 | 第58-59页 |
| ·pIFN-γ′-his tag蛋白的Western-blot鉴定 | 第59页 |
| ·pIFN-γ′-his tag蛋白的Ni亲和层析 | 第59-60页 |
| ·pIFN-γ′-his tag蛋白表达量的测定 | 第60-62页 |
| ·不同蛋白样品IPEC-J2细胞刺激活性的测定 | 第62-70页 |
| ·IPEC-J2细胞刺激实验方法与所用蛋白样品的制备 | 第62页 |
| ·IPEC-J2细胞总RNA的提取和逆转录 | 第62-63页 |
| ·RT-qPCR的引物特异性检测 | 第63-64页 |
| ·RT-qPCR的重复性检测 | 第64-65页 |
| ·RT-qPCR最佳退火温度的确定 | 第65页 |
| ·RT-qPCR标准曲线的建立 | 第65-67页 |
| ·RT-qPCR检测IPEC-J2细胞在不同蛋白样品刺激下目的基因的表达水平 | 第67-70页 |
| 4 全文讨论与结论 | 第70-73页 |
| ·讨论 | 第70-72页 |
| ·结论 | 第72-73页 |
| 致谢 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-78页 |
| 附录 | 第78-81页 |
