| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-15页 |
| 1. 文献综述 | 第15-43页 |
| ·透明质酸及透明质酸酶的生化特性 | 第15-19页 |
| ·透明质酸结构、功能及分布 | 第15-16页 |
| ·透明质酸酶的生理功能 | 第16-17页 |
| ·透明质酸酶的分类 | 第17页 |
| ·PH20的理化性质 | 第17-19页 |
| ·以透明质酸酶为关键技术的皮下给药平台 | 第19-25页 |
| ·胞外基质是药物传递的主要物理屏障 | 第19-21页 |
| ·克服胞外基质屏障的策略 | 第21-22页 |
| ·透明质酸酶产品的发展历史及应用范围 | 第22-24页 |
| ·重组人源透明质酸酶联合给药生物利用度的考察及提升空间 | 第24-25页 |
| ·透明质酸酶用于靶向微环境肿瘤治疗 | 第25-29页 |
| ·实体瘤的生理生化特征 | 第25-26页 |
| ·透明质酸对肿瘤发展的意义 | 第26-27页 |
| ·靶向透明质酸的肿瘤治疗 | 第27-29页 |
| ·重组蛋白药物长效改造策略 | 第29-32页 |
| ·定点突变 | 第29-30页 |
| ·化学修饰 | 第30-31页 |
| ·融合蛋白 | 第31-32页 |
| ·重组蛋白的表达及其关键技术 | 第32-40页 |
| ·重组蛋白表达系统 | 第32-34页 |
| ·基因表达策略 | 第34-36页 |
| ·细胞培养工艺 | 第36-38页 |
| ·四种常规层析手段 | 第38-40页 |
| ·论文的立题思想 | 第40-43页 |
| 2. 重组透明质酸酶分子构建、转染与克隆筛选 | 第43-73页 |
| ·引言 | 第43页 |
| ·实验材料与仪器 | 第43-45页 |
| ·实验材料与药品 | 第43-44页 |
| ·实验仪器 | 第44-45页 |
| ·分子设计思路与构建策略 | 第45-47页 |
| ·实验方法 | 第47-58页 |
| ·信号肽序列与目的基因的扩增 | 第47-50页 |
| ·融合基因的扩增 | 第50-51页 |
| ·克隆载体的构建及测序 | 第51-52页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第52-53页 |
| ·含融合基因片段的双顺反子表达载体的构建 | 第53-54页 |
| ·去除双顺反子表达载体的抗性筛选标记 | 第54-55页 |
| ·重组表达载体转化宿主细胞与克隆筛选 | 第55-56页 |
| ·克隆以及细胞表达能力的比较 | 第56页 |
| ·流式细胞术进行细胞分析与分选 | 第56-57页 |
| ·蛋白质免疫斑点杂交法 | 第57页 |
| ·透明质酸酶活性检测方法的建立 | 第57-58页 |
| ·实验结果 | 第58-70页 |
| ·分段扩增各段目的基因以及重叠PCR获得全长 | 第58-60页 |
| ·克隆载体、表达载体以及双顺反子表达载体的构建 | 第60-61页 |
| ·克隆表达水平与亚克隆 | 第61-66页 |
| ·不同宿主细胞系对蛋白表达量的影响 | 第66页 |
| ·载体结构对蛋白表达量的影响 | 第66-67页 |
| ·顺反子表达载体对克隆筛选的作用及筛选标记neo对表达量的影响 | 第67-69页 |
| ·高通量透明质酸活性检测方法的建立 | 第69-70页 |
| ·本章小结 | 第70-73页 |
| 3. 细胞培养与蛋白纯化工艺摸索 | 第73-101页 |
| ·引言 | 第73-74页 |
| ·材料与仪器 | 第74-75页 |
| ·实验材料与药品 | 第74页 |
| ·实验仪器 | 第74-75页 |
| ·实验方法 | 第75-81页 |
| ·重组细胞无血清悬浮驯化 | 第75页 |
| ·批次实验考察40 mL摇瓶中悬浮培养基础表达量 | 第75页 |
| · 40 mL摇瓶中流加培养 | 第75页 |
| ·L摇瓶中流加培养 | 第75页 |
| ·激流式生物反应器中流加培养 | 第75页 |
| ·蛋白质免疫印迹分析(Western blot) | 第75-76页 |
| ·细胞培养液残糖测定 | 第76页 |
| ·镍柱亲和层析分离带有His标签的rhPH20 | 第76-77页 |
| ·采用离子交换介质对rhPH20-HSA进行快速捕获 | 第77页 |
| ·蓝胶对rhPH20-HSA进行中度纯化 | 第77-79页 |
| ·Phenyl疏水层析柱纯化条件摸索 | 第79-80页 |
| ·采用亲和介质分离重组蛋rhPH20-Fc | 第80页 |
| ·冻干制剂配方筛选 | 第80-81页 |
| ·重组蛋白制剂稳定性考察 | 第81页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE分析 | 第81页 |
| ·高效液相色谱 | 第81页 |
| ·实验结果与讨论 | 第81-99页 |
| ·高表达克隆无血清悬浮批次筛选 | 第81-87页 |
| · 40 mL摇瓶流加培养及初步工艺 | 第87-88页 |
| ·3L摇瓶流加培养工艺放大 | 第88-89页 |
| ·5L激流式反应器流加培养工艺优化 | 第89页 |
| ·镍柱亲和层析分离带有His标签的rhPH20蛋白 | 第89-90页 |
| ·采用Q SFF对rhPH20-HSA纯化条件及结果 | 第90-92页 |
| ·复合填料蓝胶分离rhPH20-HSA条件优化 | 第92-94页 |
| ·疏水介质分离rhPH20-HSA条件优化 | 第94-96页 |
| ·采用MabSelect对rhPH20-Fc亲和层析纯化结果 | 第96-97页 |
| ·三种重组蛋白比活性的比较 | 第97-98页 |
| ·重组蛋白冻干制剂配方筛选与稳定性考察 | 第98-99页 |
| ·本章小结 | 第99-101页 |
| 4. 透明质酸酶在皮下给药中的应用 | 第101-111页 |
| ·引言 | 第101页 |
| ·材料与仪器 | 第101-102页 |
| ·实验材料与药品 | 第101-102页 |
| ·实验仪器 | 第102页 |
| ·实验方法 | 第102-104页 |
| ·重组透明质酸酶在台盼蓝皮下扩散过程中的影响 | 第102页 |
| ·不同浓度透明质酸酶对台盼蓝皮下扩散的影响 | 第102页 |
| ·皮下注射透明质酸酶后小鼠皮肤重建实验 | 第102-103页 |
| ·单抗药物Stelara联合重组透明质酸酶皮下给药 | 第103页 |
| ·体药物TNFR Ⅱ-Fc-IL1ra联合重组透明质酸酶联皮内给药 | 第103页 |
| ·检测方法 | 第103-104页 |
| ·实验结果与讨论 | 第104-109页 |
| ·不同重组透明质酸酶对台盼蓝皮内扩散的影响 | 第104-105页 |
| ·透明质酸酶的剂量依赖性 | 第105-106页 |
| ·重组透明质酸酶皮下稳定性 | 第106-107页 |
| ·透明质酸酶与大分子蛋白药物联合皮下给药 | 第107-109页 |
| ·本章小结 | 第109-111页 |
| 5. 透明质酸酶对不同尺寸肿瘤治疗药物促进效果的比较性研究 | 第111-135页 |
| ·引言 | 第111-112页 |
| ·材料与仪器 | 第112-113页 |
| ·实验材料与药品 | 第112页 |
| ·实验仪器 | 第112-113页 |
| ·实验方法 | 第113-117页 |
| ·细胞培养以及构建荷瘤小鼠 | 第113页 |
| ·细胞杀伤效果检测 | 第113-114页 |
| ·3D细胞球内药物扩散 | 第114页 |
| ·3D细胞透明质酸免疫组化 | 第114页 |
| ·3D细胞球生长曲线 | 第114-115页 |
| ·TUNEL检测 | 第115页 |
| ·透明质酸酶的体内稳定性研究 | 第115-116页 |
| ·肿瘤IFP检测 | 第116页 |
| ·肿瘤透明质酸免疫组化 | 第116页 |
| ·体内肿瘤抑制效果考察 | 第116-117页 |
| ·实验结果与讨论 | 第117-132页 |
| ·二维、三维培养水平的细胞毒性比较以及透明质酸酶的影响 | 第117-120页 |
| ·透明质酸酶对不同药物3D细胞球内扩散促进效果 | 第120-123页 |
| ·3D细胞球生长抑制 | 第123-126页 |
| ·透明质酸酶体内稳定性考察 | 第126-127页 |
| ·肿瘤微环境的变化 | 第127-129页 |
| ·瘤内药物分布与蓄积 | 第129-130页 |
| ·肿瘤生长曲线及分析 | 第130-132页 |
| ·本章小结 | 第132-135页 |
| 6. 结论与展望 | 第135-141页 |
| ·主要结论 | 第135-137页 |
| ·创新点总结 | 第137-138页 |
| ·今后工作建议 | 第138-141页 |
| 7. 缩写词 | 第141-143页 |
| 8. 参考文献 | 第143-153页 |
| 个人简历及发表文章目录 | 第153-155页 |
| 致谢 | 第155页 |
