抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)天然化合物及其衍生物体外筛选与分子机制研究

【摘要】：目的：从36种天然化合物及其衍生物中初步筛选出体外具有抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiration syndrome virus, PRRS V)的药物,再进一步探讨其抗病毒机制。方法：本试验首先采用细胞病变法(cytopathologic effect, CPE)和噻唑蓝比色法(3-(4,5-dimethyithiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)在细胞水平来测定供试药物在Marc-145细胞上的最大安全浓度(maximum no-cytotoxic concentration, MNTC)、50%细胞毒性浓度(50%c ytotoxic concentration, CC50),在最大安全范围内进一步确定50%药物有效浓度(50% effective concentration, EC50)以及供试药物对PRRSV的最大抑制率(naximum inhibition ratio, MIR),筛选出MIR高于50%且选择指数(selection index, SI)大于3的药物。然后,通过直接灭活病毒试验、复制抑制试验和吸附抑制试验初步解释药物抗病毒机制。最后,采用荧光定量PCR检测化合物在不同时间点对PRRSV N 基因和细胞基因 (PABP. PCBP1、PCBP2)的影响,同时还通过Western blot检测不同时间点药物对N蛋白表达的影响。除此之外,还通过Annexin V/PI双染法研究药物对PRRSV诱导细胞凋亡的影响。结果：从36种天然化合物中筛选出No.3(苯丙酸衍生物,反式烯键已被饱和掉)、No.27(甾体胆酸类衍生物)、No.30(即TS,表征茶皂素部位),No.32、No.33、No.34、No.35(均为甘草次酸类化合物)共7种药物在Marc-145细胞上具有抗PRRSV作用,且呈剂量依赖关系。其中,TS抑制率最高为100%,TS在病毒复制1-14 h间抑制率均高于76%,阻断PRRSV吸附于细胞的抑制率均高于65%且对PRRSV的直接灭活率高于80%。荧光定量PCR结果显示感染病毒20 h-52 h后,TS可显著抑制PRRSV N基因合成(P0.001),感染24 h,TS处理组与病毒对照组做比较,只有PABP mRNA表达量下降(P0.001)。Western blot结果显示TS处理组对PRRSV N蛋白表达呈抑制作用,且呈剂量依赖性。此外,TS处理组的晚期细胞的凋亡量明显低于PRRSV对照组。结论：TS在体外Marc-145细胞模型上具有抗PRRSV的作用。其抗病毒机制可能是通过直接杀灭PRRSV、持续抑制PRRSV复制、影响PRRSV吸附以及干扰细胞凋亡来实现的。此外,TS处理组通过抑制N基因合成及其蛋白表达,下调PABP mRNA的表达量,进一步解释了其抗病毒机制。
【关键词】：天然化合物及其衍生物 PRRSV No.30(TS) N蛋白 PABP 细胞凋亡
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：S855.3