| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 目录 | 第9-13页 |
| 主要缩略词 | 第13-14页 |
| 引言 | 第14-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-55页 |
| 综述一 牛病毒性腹泻病毒的研究进展 | 第15-29页 |
| 1、BVDV概况 | 第15-18页 |
| 2、BVDV基因组结构及功能 | 第18-23页 |
| 3、BVDV的持续感染 | 第23-29页 |
| 综述二 转基因动物的研究进展 | 第29-35页 |
| 1、转基因动物制作方法 | 第29-31页 |
| 2、转基因动物的应用前景 | 第31-32页 |
| 3、转基因动物研究中存在的问题 | 第32-35页 |
| 综述三 RNA干扰及其在抗病毒中的应用 | 第35-55页 |
| 1、RNAI分子机制 | 第36-40页 |
| 2、RNAI与MIRNA | 第40-47页 |
| 3、RNAI与抗病毒研究 | 第47-55页 |
| 第二章 实验研究 | 第55-131页 |
| 实验一 高效抑制BVDV复制SHRNA干扰片段的设计及筛选 | 第55-71页 |
| 摘要 | 第55-56页 |
| 1 材料 | 第56页 |
| ·病毒和细胞 | 第56页 |
| ·载体和菌株 | 第56页 |
| ·限制性内切酶、工具酶及试剂盒 | 第56页 |
| 2 方法 | 第56-64页 |
| ·靶向BVDVshRNA片段的设计及合成 | 第56-57页 |
| ·靶向BVDVshRNA干扰载体的构建 | 第57-60页 |
| ·shRNA干扰载体转染MDBK细胞 | 第60-61页 |
| ·细胞攻毒 | 第61页 |
| ·荧光定量PCR检测BVDVmRNA的表达 | 第61-64页 |
| ·病毒TCID50检测 | 第64页 |
| 3 结果 | 第64-69页 |
| ·靶向BVDVshRNA干扰载体的构建 | 第64-66页 |
| ·shRNA干扰载体对病毒接种后细胞病变情况的影响 | 第66-67页 |
| ·荧光定量PCR检测shRNA干扰载体的抗病毒效果 | 第67-68页 |
| ·TCID50检测shRNA干扰载体的抗病毒效果 | 第68-69页 |
| 4 讨论 | 第69-70页 |
| ·RNAi片段的选择 | 第69-70页 |
| ·双干扰片段的设计 | 第70页 |
| ·细胞水平抗BVDV效果评价 | 第70页 |
| 5 小结 | 第70-71页 |
| 实验二 抗BVDV转基因阳性绵羊胎儿成纤维细胞的制备 | 第71-85页 |
| 摘要 | 第71-72页 |
| 1 材料 | 第72页 |
| ·菌种及质粒 | 第72页 |
| ·限制性内切酶和工具酶 | 第72页 |
| 2 方法 | 第72-76页 |
| ·转基因表达载体的构建 | 第72-73页 |
| ·绵羊胎儿成纤维细胞的分离 | 第73页 |
| ·靶向BVDV转基因表达载体pNeo-2loxp-u6-shBVDV线性化 | 第73-74页 |
| ·G-418绵羊胎儿成纤维细胞最佳筛选浓度的测定 | 第74页 |
| ·线性化的pNeo-2loxp-u6-shBVDV转染绵羊胚胎成纤维细胞 | 第74页 |
| ·细胞的筛选 | 第74-75页 |
| ·阳性细胞的鉴定 | 第75-76页 |
| 3 结果 | 第76-81页 |
| ·转基因载体pNeo-2loxp-u6-shBVDV鉴定 | 第76页 |
| ·绵羊胎儿成纤维细胞的分离培养 | 第76-78页 |
| ·转基因阳性细胞的获得 | 第78-79页 |
| ·阳性细胞抗病毒效果分析 | 第79-81页 |
| 4 讨论 | 第81-83页 |
| ·绵羊胎儿成纤维细胞的分离培养 | 第81页 |
| ·细胞转染和稳定筛选 | 第81-82页 |
| ·转基因绵羊胎儿成纤维细胞的培养和鉴定 | 第82页 |
| ·转基因细胞对BVDV复制的抑制作用 | 第82-83页 |
| 5 小结 | 第83-85页 |
| 实验三 抗BVDV转基因绵羊抗病毒效果评价 | 第85-101页 |
| 摘要 | 第85-86页 |
| 1 材料 | 第86页 |
| ·实验动物 | 第86页 |
| ·主要试剂 | 第86页 |
| ·主要仪器设备 | 第86页 |
| 2 方法 | 第86-89页 |
| ·体细胞核移植 | 第86-88页 |
| ·胚胎移植 | 第88页 |
| ·妊娠诊断 | 第88页 |
| ·转基因绵羊外源基因整合鉴定 | 第88页 |
| ·shRNA在转基因绵羊中的表达分析 | 第88-89页 |
| ·细胞水平抗BVDV能力检测 | 第89页 |
| 3 结果 | 第89-96页 |
| ·绵羊卵母细胞的成熟培养 | 第89-90页 |
| ·重构胚胎的体外发育 | 第90-91页 |
| ·靶向抑制BVDV复制转基因绵羊的研究 | 第91页 |
| ·转基因绵羊PCR鉴定 | 第91-92页 |
| ·shRNA在转基因绵羊中的表达分析 | 第92页 |
| ·流产胎儿成纤维细胞、肾上皮细胞的分离培养及细胞水平抗BVDV能力检测 | 第92-96页 |
| 4 讨论 | 第96-99页 |
| ·shRNA转基因绵羊的制备 | 第96-97页 |
| ·转基因动物流产及克隆效率低 | 第97-98页 |
| ·转基因绵羊体细胞抗BVDV感染能力的初步评价 | 第98-99页 |
| 5 小结 | 第99-101页 |
| 实验四 MIR-1249在MDBK细胞中的抗BVDV研究 | 第101-131页 |
| 摘要 | 第101-102页 |
| 1 材料 | 第102页 |
| ·细胞、病毒 | 第102页 |
| ·主要试剂 | 第102页 |
| 2 方法 | 第102-113页 |
| ·总体技术路线 | 第102页 |
| ·测序样品准备 | 第102-103页 |
| ·高通量测序 | 第103页 |
| ·凋亡相关microRNA预测及分析 | 第103-104页 |
| ·microrRNA的验证 | 第104-106页 |
| ·miR-1249功能分析(凋亡检测) | 第106-107页 |
| ·miR-1249靶点验证 | 第107-113页 |
| 3 结果 | 第113-123页 |
| ·建立病毒感染miRNA表达谱 | 第113-114页 |
| ·差异表达miRNAs筛选及鉴定 | 第114-115页 |
| ·miR-1249表达验证 | 第115-116页 |
| ·miR-1249功能研究 | 第116-119页 |
| ·miR-1249靶基因研究 | 第119-123页 |
| 4 讨论 | 第123-129页 |
| ·miR-1249功能研究 | 第123-125页 |
| ·miR-1249作用靶点分析 | 第125-126页 |
| ·Bcl-2蛋白表达量分析 | 第126-127页 |
| ·miR-1249靶基因调节细胞凋亡的分子机制 | 第127-128页 |
| ·抗BVDV转基因绵羊抗病育种新思路 | 第128-129页 |
| 5 小结 | 第129-131页 |
| 第三章 全文结论与创新点 | 第131-133页 |
| 全文结论 | 第131页 |
| 创新点 | 第131-133页 |
| 参考文献 | 第133-149页 |
| 附录 | 第149-153页 |
| 附件（一） 实验一技术路线 | 第149-150页 |
| 附件（二） 实验二技术路线 | 第150-151页 |
| 附件（三） 实验三技术路线 | 第151-152页 |
| 附件（四） 实验四技术路线 | 第152-153页 |
| 致谢 | 第153-155页 |
| 个人简历 | 第155-157页 |
| 导师评阅表 | 第157页 |
