| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-11页 |
| 第1章 前言 | 第11-24页 |
| ·无标记基因操作的发展及应用 | 第11-15页 |
| ·利用重组酶的无标记基因操作 | 第11-12页 |
| ·利用反向筛选实现无标记基因操作 | 第12-15页 |
| ·合成S-腺苷甲硫氨酸的代谢工程研究 | 第15-19页 |
| ·S-腺苷甲硫氨酸简介 | 第15-17页 |
| ·SAM合成酶在毕赤酵母中的强化表达 | 第17-18页 |
| ·SAM分解代谢途径的弱化 | 第18页 |
| ·强化供氧及ATP的合成促进SAM的产生 | 第18-19页 |
| ·利用启动子有效调控基因表达 | 第19-22页 |
| ·利用诱导表达系统调控基因表达 | 第20-21页 |
| ·利用启动子文库调控基因表达 | 第21-22页 |
| ·课题内容及意义 | 第22-24页 |
| 第2章 材料与方法 | 第24-37页 |
| ·材料 | 第24-31页 |
| ·质粒、菌株和引物 | 第24-28页 |
| ·实验试剂 | 第28-29页 |
| ·实验仪器 | 第29-30页 |
| ·培养基 | 第30页 |
| ·溶液 | 第30-31页 |
| ·实验方法 | 第31-37页 |
| ·分子生物学方法 | 第31-33页 |
| ·分析方法 | 第33-36页 |
| ·MazF-ZeoR反向筛选过程 | 第36页 |
| ·重组毕赤酵母的摇瓶发酵 | 第36-37页 |
| 第3章 建立无标记基因操作方法弱化SAM分解代谢途径 | 第37-52页 |
| ·反向筛选标记mazF的获取与功能验证 | 第37-40页 |
| ·mazF的获取与表达载体的构建 | 第37-38页 |
| ·mazF的功能验证 | 第38-40页 |
| ·利用mazF构建无标记基因操作单元MazF-ZeoR | 第40-44页 |
| ·利用MazF-ZeoR单元弱化SAM分解代谢途径β-胱硫醚合成酶的表达 | 第44-51页 |
| ·含有MazF-ZeoR单元的β-胱硫醚合成酶弱化载体的构建 | 第45-47页 |
| ·重组质粒pCmG转化毕赤酵母及筛选标记的回收 | 第47-50页 |
| ·摇瓶发酵考察重组菌的生理特性 | 第50-51页 |
| ·小结 | 第51-52页 |
| 第4章 低氧诱导启动子PsADH2在毕赤酵母中的调控特性研究 | 第52-63页 |
| ·报告基因gfp和lacZ在GS115中的表达 | 第52-55页 |
| ·PsADH2启动子调控报告基因表达载体的构建 | 第52-54页 |
| ·重组菌G/AHg、G/AHL、G/AHV的构建 | 第54-55页 |
| ·PsADH2启动子在不同限氧条件时的调控特性 | 第55-57页 |
| ·限氧条件对报告基因转录的影响 | 第55-56页 |
| ·限氧条件对报告基因蛋白表达的影响 | 第56-57页 |
| ·PsADH2启动子在发酵过程中的调控特性 | 第57-59页 |
| ·PsADH2启动子在发酵中后期自发动态调控外源基因表达 | 第57-58页 |
| ·PsADH2启动子调控外源基因的表达对菌体生长的影响 | 第58-59页 |
| ·不同碳源对PsADH2启动子调控特性的影响 | 第59页 |
| ·PsADH2启动子与AOX1启动子调控vgb表达的比较 | 第59-62页 |
| ·重组菌G/AOX1-vgb的构建 | 第59-60页 |
| ·重组菌G/AOX1-vgb与G/AHV生长的比较 | 第60-61页 |
| ·重组菌G/AOX1-vgb与G/AHV中VHb表达量的比较 | 第61-62页 |
| ·小结 | 第62-63页 |
| 第5章 弱化转化途径同时导入vgb基因促进SAM合成 | 第63-72页 |
| ·插入载体的构建 | 第63-66页 |
| ·重组菌构建及筛选标记回收 | 第66-69页 |
| ·重组质粒转化毕赤酵母 | 第66-68页 |
| ·重组菌DS16/DsvP的筛选及基因型验证 | 第68页 |
| ·重组菌DS16/DsvA筛选过程及基因型验证 | 第68-69页 |
| ·摇瓶培养考察重组菌的生理特性 | 第69-71页 |
| ·重组菌的生长 | 第69-70页 |
| ·重组菌的SAM产量和酶活 | 第70-71页 |
| ·小结 | 第71-72页 |
| 第6章 结论与展望 | 第72-74页 |
| ·主要结论 | 第72-73页 |
| ·展望 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-80页 |
| 致谢 | 第80页 |
